多肽的制备方法技术

本申请公开了包含YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI(SEQ ID NO.1)的多肽的制备方法，其包括：基于Fmoc多肽合成法，按照从C端至N端方向合成所述多肽，其中在连接SEQ ID NO.1的自C端第9个氨基酸Y时，在第一缩合剂的存在下进行第一缩合反应，并且在第二缩合剂的存在下进行第二缩合反应，所述第一缩合剂和第二缩合剂是不同的。本申请的上述多肽制备方法能制备出高纯度的多肽产物。多肽产物。

【技术实现步骤摘要】
多肽的制备方法


[0001]本申请大体涉及蛋白质工程领域，更具体而言，本申请提供了针对包含YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI(SEQ ID NO.1)的多肽的新的制备方法。

技术介绍

[0002]本申请的申请人名下的PCT申请WO2017/185249A1中公开了用于治疗兴奋性神经毒性相关疾病的以PSD
‑
95为靶点的全新多肽药物，其中代表性的多肽为YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI。在此基础上，本申请的申请人进行了深入研发，提出了适用于该多肽以及其他相关多肽的改进的合成方法。
[0003]专利技术概述
[0004]第一方面，本申请提供了制备包含YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI(SEQ ID NO.1)的多肽的方法，其包括：基于Fmoc多肽合成法，按照从C端至N端方向合成所述多肽，其中在连接SEQ ID NO.1的自C端第9个氨基酸Y时，在第一缩合剂的存在下进行第一缩合反应，并且在第二缩合剂的存在下进行第二缩合反应，所述第一缩合剂和第二缩合剂是不同的。
[0005]在第一方面的一些实施方案中，所述第一缩合剂选自以下中的一种或多种：N,N
‑
二异丙基碳二亚胺(DIC)、1
‑
羟基苯并三氮唑(HOBt)、6
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
苯并三氮唑(6
‑
Cl
‑
HOBt)、1
‑
羟基
‑7‑
氮杂苯并三氮唑(HOAt)、N,N'
‑
二环己基碳二亚胺(DCC)、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)、羰基二咪唑(CDI)、六氟磷酸苯并三唑
‑1‑
基
‑
氧基三吡咯烷基(PyBOP)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBroP)、3
‑
(二乙氧基磷酰氧基)
‑
1,2,3
‑
苯并三嗪
‑4‑
酮(DEPBT)、2
‑
乙氧基
‑1‑
乙氧碳酰基
‑
1,2
‑
二氢喹啉(EEDQ)、O
‑
苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、6
‑
氯苯并三氮唑
‑
1,1,3,3
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)和O
‑
苯并三氮唑
‑
四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)。
[0006]在第一方面的一些实施方案中，所述第二缩合剂选自以下中的一种或多种：DIC、HOBt、6
‑
Cl
‑
HOBt、HOAt、DCC、EDC、CDI、PyBOP、PyBroP、DEPBT、EEDQ、TBTU、HATU、HCTU和HBTU。
[0007]在第一方面的一些实施方案中，所述第一缩合反应和/或第二缩合反应在选自以下中的一种或多种碱存在的情况下进行：N
‑
二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、N
‑
甲基吗啡啉(NMM)、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、4
‑
二甲氨基吡啶(DMAP)、1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(DBU)。
[0008]在第一方面的一些实施方案中，所述第一缩合反应和/或第二缩合反应在选自以下中的一种或多种溶剂中进行：N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N
‑
甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N
‑
二甲基乙酰胺(DMA)、1,4
‑
二氧六环、乙腈、二甲基亚砜、甲苯、二甲苯。
[0009]在第一方面的一些实施方案中，在所述第一缩合反应和/或所述第二缩合反应中氨基酸Y的保护氨基酸的投入量为固相载体的氨基总摩尔量的1.5～4.0倍。
[0010]在第一方面的一些实施方案中，所述第一缩合剂的用量为氨基酸Y的保护氨基酸的投入量的1.0～4.0倍。
[0011]在第一方面的一些实施方案中，所述第二缩合剂的用量为氨基酸Y的保护氨基酸的投入量的1.0～4.0倍。
[0012]在第一方面的一些实施方案中，所述第一缩合反应和/或所述第二缩合反应的反应温度为0～35℃。
[0013]在第一方面的一些实施方案中，所述第一次缩合反应的时间为30～120min。
[0014]在第一方面的一些实施方案中，所述第二次缩合反应的时间为30～120min。
[0015]在第一方面的一些实施方案中，其中所述方法还包括在所述第一次缩合反应前对已接入的氨基酸进行脱保护处理。
[0016]在第一方面的一些实施方案中，所述脱保护处理中使用的脱保护剂为含有20％(v/v)哌啶(PIP)和5％(g/v)1
‑
羟基苯并三氮唑(HOBt)的N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)溶液或含有20％(v/v)PIP的DMF溶液。
[0017]在第一方面的一些实施方案中，在连接SEQ ID NO.1的自C端第10个氨基酸R时，在所述第一缩合剂的存在下进行第三缩合反应，并且在所述第二缩合剂的存在下进行第四缩合反应。
[0018]在第一方面的一些实施方案中，在连接SEQ ID NO.1的自C端第11个氨基酸R时，在所述第一缩合剂的存在下进行第五缩合反应，并且在所述第二缩合剂的存在下进行第六缩合反应。
[0019]在第一方面的一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成，并且所述方法包括将SEQ ID NO.1的自C端的第1个氨基酸I与固相载体连接，然后按照SEQ ID NO.1所示氨基酸序列从C端至N端通过缩合反应依次接入相应的氨基酸，得到包含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽
‑
固相载体。
[0020]在第一方面的一些实施方案中，对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列使用的保护氨基酸从C端至N端依次为：Fmoc
‑
Ile
‑
OH、Fmoc
‑
Glu(OtBu)
‑
OH.H2O、Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Leu
‑
OH、Fmoc
‑
Leu
‑
OH、Fmoc
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备包含YGRKKRRQRRRYEKLLDTEI(SEQ ID NO.1)的多肽的方法，其包括：基于Fmoc多肽合成法，按照从C端至N端方向合成所述多肽，其中在连接SEQ ID NO.1的自C端第9个氨基酸Y时，在第一缩合剂的存在下进行第一缩合反应，并且在第二缩合剂的存在下进行第二缩合反应，所述第一缩合剂和第二缩合剂是不同的。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一缩合剂选自以下中的一种或多种：N,N
‑
二异丙基碳二亚胺(DIC)、1
‑
羟基苯并三氮唑(HOBt)、6
‑
氯
‑1‑
羟基
‑
苯并三氮唑(6
‑
Cl
‑
HOBt)、1
‑
羟基
‑7‑
氮杂苯并三氮唑(HOAt)、N,N'
‑
二环己基碳二亚胺(DCC)、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)、羰基二咪唑(CDI)、六氟磷酸苯并三唑
‑1‑
基
‑
氧基三吡咯烷基(PyBOP)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBroP)、3
‑
(二乙氧基磷酰氧基)
‑
1,2,3
‑
苯并三嗪
‑4‑
酮(DEPBT)、2
‑
乙氧基
‑1‑
乙氧碳酰基
‑
1,2
‑
二氢喹啉(EEDQ)、O
‑
苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、6
‑
氯苯并三氮唑
‑
1,1,3,3
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)和O
‑
苯并三氮唑
‑
四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，优选地，所述第一缩合剂包含DIC和HOBt；和/或所述第二缩合剂选自以下中的一种或多种：DIC、HOBt、6
‑
Cl
‑
HOBt、HOAt、DCC、EDC、CDI、PyBOP、PyBroP、DEPBT、EEDQ、TBTU、HATU、HCTU和HBTU，优选地，所述第二缩合剂包含6
‑
Cl
‑
HOBt和HBTU；和/或所述第一缩合反应和/或第二缩合反应在选自以下中的一种或多种碱存在的情况下进行：N
‑
二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、N
‑
甲基吗啡啉(NMM)、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、4
‑
二甲氨基吡啶(DMAP)、1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯(DBU)，优选地，所述碱为DIPEA；和/或所述第一缩合反应和/或第二缩合反应在选自以下中的一种或多种溶剂中进行：N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N
‑
甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N
‑
二甲基乙酰胺(DMA)、1,4
‑
二氧六环、乙腈、二甲基亚砜、甲苯、二甲苯，优选地，所述溶剂为DMF和/或DCM。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一缩合反应在DIC和HOBt存在的情况下进行，和所述第二缩合反应在6
‑
Cl
‑
HOBt、HBTU和DIPEA存在的情况下进行。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中在所述第一缩合反应和/或所述第二缩合反应中氨基酸Y的保护氨基酸的投入量为固相载体的氨基总摩尔量的1.5～4.0倍，优选在所述第一缩合反应中氨基酸Y的保护氨基酸的投入量为固相载体的氨基总摩尔量的3倍，和/或在所述第二缩合反应中氨基酸Y的保护氨基酸的投入量为固相载体的氨基总摩尔量的2倍；和/或所述第一缩合剂的用量为氨基酸Y的保护氨基酸的投入量的1.0～4.0倍，优选为1.0～3.0倍，更优选为2.4倍；和/或所述第二缩合剂的用量为氨基酸Y的保护氨基酸投入量的1.0～4.0倍，优选为1.0～3.0倍，更优选为2.4倍；和/或所述第一缩合反应和/或所述第二缩合反应的反应温度为0～35℃，优选为10℃
±
3℃；和/或所述第一缩合反应的时间为30～120min，优选为50～80min；和/或所述第二缩合反应的时间为30～120min，优选为50～100min。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述第一缩合反应前
对已接入的氨基酸进行脱保护处理；任选地，所述脱保护处理中使用的脱保护剂为含有20％...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩化敏，
申请(专利权)人：拜西欧斯北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：