一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用，miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括与miR‑135a‑5p种子序列结合的两处野生型位点片段、第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段、第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。本发明专利技术提供了一种多位点结合、可快速直接检测miRNA和预测靶基因的结合、能够节约研究成本以及缩短实验周期的miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种荧光载体及构建方法，尤其涉及一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。
技术介绍
随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变成为一项重要的实验技术手段，在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等研究中得到广泛应用。目前，PCR介导的定点突变技术即重叠引物延伸PCR是使用最普遍的定点突变方法，可以在DNA区段的任何位置突变。microRNA(miRNA)是一类内源性的、保守的、长度为19-23个核苷酸的非编码小分子RNA。1993年，科学家们首次在秀丽新小杆线虫中发现了具有调节其发育时序性的miRNA，即lin-4。lin-4与靶mRNAlin-14的3'UTR反向互补结合，从了抑制了lin-14基因的翻译。miRNA在生物体中主要以两种方式调控靶标基因的表达，即靶基因的剪切降解和翻译抑制。当miRNA序列与靶mRNA序列完全配对时则引起靶mRNA的剪切和降解，这种情况多见于植物中。而在动物体中，通常是miRNA的“种子序列”(第2-8个核苷酸)与靶mRNA结合，导致靶mRNA的翻译抑制，进而影响各种生命进程。在前期研究发现，miR-135a-5p可能是调控脂肪发育的关键因子。软件预测Apc基因是miR-135a-5p的潜在靶基因，且在Apc基因的3′UTR有两个结合位点(AAGCCAT，AAAGCCA)，如图1所示。目前，针对miRNA“种子序列”和靶基因结合的验证，双荧光素酶报告载体试验是一种常见的方法，但都是基于单个结合位点的验证。专利技术内容为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种多位点结合、可快速直接检测miRNA和预测靶基因的结合、能够节约研究成本以及缩短实验周期的miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括与miR-135a-5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。作为优选，两处野生型位点片段的引物序列是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；以及，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d；第一个突变位点片段的引物序列是：5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'，记为引物b1；5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'，记为引物c1；第二个突变位点片段的引物序列是：5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'，记为引物b2；5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'，记为引物c2。一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：1)构建野生型荧光载体；2)以步骤1)构建得到的野生型荧光载体为模板，分别构建带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及从第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段；3)将步骤2)构建得到的带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段分别进行“搭桥”，形成整体片段；4)以步骤3)得到的整体片段为模板，分别进行PCR扩增；5)将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体，经过转化、提取质粒、双酶切，连接psiCHECK-2荧光载体，挑选阳性质粒，所述阳性质粒的第一个突变位点、第二个突变位点以及两个突变位点都成功突变。作为优选，本专利技术的步骤1)的具体实现方式是：将野生型位点片段的引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，得到野生型荧光载体；所述野生型位点片段的引物序列是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d。作为优选，本专利技术的步骤2)中构建带有第一个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物a和引物b1为引物扩增带有第一个突变位点的载体片段ab1；所述引物a的序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'；所述引物b1的序列是5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'；所述步骤2)中带有第二个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c2和引物d为引物扩增带有第二个突变位点的载体片段c2d；所述引物c2的序列是5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'；所述引物d的序列是5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'；所述步骤2)中第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c1和引物b2为引物扩增第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段c1b2；所述引物c1的序列是5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'；所述引物b2的序列是5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'。作为优选，本专利技术的步骤5)中，将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体时，所述pMD-18T载体通用引物序列是：F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'。作为优选，本专利技术的步骤5)中，连接psiCHECK-2荧光载体时，所述psiCHECK-2荧光载体通用引物序列是：F：5'-GAGGACGCTCCAGATGAAAT-3'；R：5'-GAGGTCCGAAGACTCATTTA-3'。一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miRNA和预测靶基因的关系时的应用。一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miR-135a-5p和预测靶基因Apc基因的关系时的应用。本专利技术的优点是：本专利技术提供了一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用，本专利技术是基于传统的重叠延伸PCR，针对某一miRNA有两个结合位点的基因，一是探索出了三个DNA片段“搭桥”的适用条件与关键参数，提供了含有两个与miRNA“种子序列”结合的野生位点或突变位点的载体及制备方法；二是将构建的野生型或突变型荧光载体用于miRNA和预测靶基因的关系验证，实现二者之间的快速检测。本专利技术对传统的重叠延伸PCR法进行定点突变的方法进行了改进，通过片段“搭桥”和测序使一个荧光载体上含有两个与miRNA“种子序列”结合的野生位点或突变位点，通过实验验证野生型或突变型荧光载体与预测靶基因的结合。本专利技术制备方法简单，在满足实验需要的同时，节约了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括分别与miR‑135a‑5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括分别与miR-135a-5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。2.根据权利要求1所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述两处野生型位点片段的引物序列分别是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；以及，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d；第一个突变位点片段的引物序列是：5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'，记为引物b1；5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'，记为引物c1；第二个突变位点片段的引物序列是：5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'，记为引物b2；5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'，记为引物c2。3.一种如权利要求2所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：1)构建野生型荧光载体；2)以步骤1)构建得到的野生型荧光载体为模板，分别构建带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段；3)将步骤2)构建得到的带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段分别进行搭桥，形成整体片段；4)以步骤3)得到的整体片段为模板，分别进行PCR扩增；5)将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体，经过转化、提取质粒、双酶切，连接psiCHECK-2荧光载体，挑选阳性质粒，所述阳性质粒的第一个突变位点、第二个突变位点以及两个突变位点都成功突变。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：将野生型位点片段的引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，得到野生型荧光载体；所述野生型位点片段的引物序列是5'-CCGCTCGAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晨，崔清明，罗璇，谢菊兰，张星，邓缘，刘莹莹，朱吉，任慧波，胡雄贵，左剑波，彭英林，
申请(专利权)人：湖南省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43