本发明专利技术公开了一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用，该基因的CDS序列如SEQ.ID.NO.1所示。基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，包含SEQ.ID.NO.1所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因kanr/neor。奶山羊PLZF基因序列转染到雄性生殖干细胞中以促进雄性生殖干细胞自我更新的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及生殖细胞自我更新相关基因，特别涉及一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用。
技术介绍
哺乳动物的精子发生包括精原干细胞(雄性生殖干细胞)的增殖、分化、发育等一系列细胞形态和生理功能的改变，最终生成精子的整个过程。其中雄性生殖干细胞的自我更新是精子发生过程中的关键步骤，也是雄性动物终生产生精子的基础。PLZF是POZ家族的新成员，是人类精子发生过程自我更新的关键调控因子，在睾丸组织特异性表达。PLZF是一个近期被人们发现并重视的新基因(Buaas Fff, Kirsh AL，Sharma M，McLean DJj Morris 几，Griswold MD，de Rooij DGj Braun RE. PLZF isrequired in adult male germ cells for stem cell self-renewal. Nature genetics2004，36(6):647-52;Costoya JA，Hobbs RMj Barna M，et al. Essential role of PLZF inmaintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics 2004，36(6):653-9.)。PLZF即早幼粒细胞白血病锋指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger),是由中国学者在国际上首次发现并克隆的基因，亦是我国学者在国内自行发现的第一个人类疾病相关基因(Chen Zj Brand NJj Chen A, Chen SJj Tong JHj Wang ZYj Waxman S，ZelentA.Fusion between a novel Kruppel-Iike zinc finger gene and the retinoicacid receptor-alpha locus due to a variant t (11;17)translocation associatedwith acute promyelocytic leukaemia. The EMBO Journal 1993，12(3):1161-7;ChenSJjZelent A，Tong JHjet al. Rearrangements of the retinoic acid receptor alphaand promyelocytic leukemia zinc finger genes resulting from t (11;17) (q23;q21)in a patient with acute promyelocytic leukemia. The Journal of ClinicalInvestigation 1993，91 (5):2260-7.)。PLZF功能的缺失扰乱了精原干细胞(SSCs)增殖与分化之间的平衡，使之由增殖转向分化。PLZF为成年雄性动物的精原干细胞自我更新所必需的，PLZF有助于精原干细胞在雄性生殖腺中驻留。PLZF定向敲除导致雄性不育，PLZF在单个、成对或结成链状的未分化的精原细胞中均有表达(Buaas Fff, Kirsh AL, Sharma M, et al. PLZF is required inadult male germ cells for stem cell self-renewal. Nat Genet 2004, 36:647-652. X干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。已有研究证实干细胞可以在体外分化为早期生殖细胞，甚至进一步分化为卵母细胞或精子(HUbnerK，Fuhrmann G，Christenson LKj et al. Derivation of oocytes from mouse embryonicstem cells. Science，2003，300:1251 - 1256;Geijsen N，Horoschak M，Kim K，etal. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stemcells. Nature, 2004，427:148 - 154.)。虽然至今建立了多种用于雄性生殖干细胞体外增殖和分化的研究体系，Knockout实验也发现了许多调控自我更新的关键基因和蛋白，但是还不能完全实现建立体外进行自我更新和精子发生的研究模型，体外很难控制雄性生殖干细胞自我更新的起始。因此，通过构建一些增殖多能性关键基因的真核表达载体，利用其修饰体外培养雄性生殖干细胞，探索功能基因之间的关系，发现相关调控自我更新的信号途径，进而揭示自我更新过程基因之间相互作用的分子机制具有重要的科学意义。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干细胞自我更新的应用，将外源PLZF基因转染雄性生殖干细胞可促其进行自我更新，可研究PLZF对雄性生殖干细胞特异基因表达的调控作用。本专利技术是通过以下技术方案来实现 一种奶山羊PLZF基因，该基因序列如SEQ. ID. NO. I所不。一种奶山羊PLZF基因，其基因的CDS序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 一种奶山羊PLZF基因的融合基因，在奶山羊PLZF基因的下游连接荧光报告基因。所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。一种基于奶山羊PLZF基因序列构建的表达载体，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游连接荧光标记基因GFP，在GFP的下游连接抗生素筛选基因 IcanYneolrtj所述的基于PLZF基因序列构建的表达载体为pPLZF-IRES2-EGFP表达载体，通过Ecor I和BamH I酶切位点将PLZF基因克隆到pIRES2_EGFP表达载体。奶山羊PLZF基因序列转染到雄性生殖干细胞中以促进雄性生殖干细胞自我更新的应用。一种促进奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的方法，包括以下步骤I)克隆如SEQ. ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并将PLZF基因序列通过Ecor I和BamH I酶切位点克隆到pIRES2_EGFP表达载体中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表达载体；2)将待转染的奶山羊雄性生殖干细胞与PPLZF-IRES2-EGFP表达载体共同孵育，将pPLZF-IRES2-EGFP表达载体转染到雄性生殖干细胞之中；转染后3 4h，将奶山羊雄性生殖干细胞在基本培养基上添加其体积10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巯基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺进行培养；所述的基本培养液为DMEM/F12培养液或H-DMEM培养液；并在荧光显微镜下对荧光标记基因进行观察，筛选启动自我更新相关基因表达水平增高的细胞。还以人的293T细胞的转染作为对照，该细胞所采用的基本培养液为H-DMEM培养液。所述的启动自我更新相关基因为PCNA、C-MYC, 0CT4、PLZ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种奶山羊PLZF基因，其特征在于，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋文聪，华进联，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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