III型分泌系统靶向分子技术方案

本发明专利技术主要涉及特异性结合革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的细菌V‑tip蛋白例如来自铜绿假单胞菌的PcrV的分子。更具体而言，本发明专利技术涉及阻断效应分子注射到靶细胞中的分子。本发明专利技术还涉及特异性结合细菌脂蛋白例如OprI的分子。本发明专利技术的分子是单特异性的或多特异性的，并能以单价或多价方式结合其靶抗原。本发明专利技术还主要涉及特异性结合细菌细胞表面蛋白例如OprI的分子，以及在多种治疗、诊断和/或预防性适应症中使用这些分子的方法。

Target molecules of III type secretory system

The present invention relates to a III type specific combination of gram negative bacteria secretion system V tip protein from bacteria such as Pseudomonas aeruginosa PcrV molecules. More specifically, the invention relates to molecules that block effect molecules to be injected into the target cells. The invention also relates to a molecule that specifically combines with bacterial lipoprotein, such as OprI. The molecules of the invention are monospecific or multispecific, and with monovalent or multivalent with its target antigen. The invention also relates mainly to molecules that specifically bind to bacterial cell surface proteins, such as OprI, and to use these molecules in various therapeutic, diagnostic and / or preventive indications.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】III型分泌系统靶向分子相关申请本申请要求2015年5月1日提交的美国临时申请No.62/155967和2015年11月13日提交的美国临时申请No.62/254992的权益，其各自的内容通过参照以其整体结合于此。专利
本专利技术主要涉及特异性结合革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的细菌V-tip蛋白例如来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的PcrV的分子。更具体而言，本专利技术涉及阻断或以其它方式抑制效应分子注射到靶细胞中的分子。本专利技术的分子是单特异性的或多特异性的，并能以单价或多价方式结合其靶抗原。在一些实施方案中，这些抗体可与结合假单胞菌属(Pseudomonas)蛋白OprI的细菌表面靶向组分组合。本专利技术还主要涉及特异性结合细菌细胞表面蛋白例如OprI的分子和在多种治疗、诊断和/或预防性适应症中使用这些分子的方法。专利技术背景铜绿假单胞菌的V-tip蛋白(PcrV)是能够注射毒性效应分子到真核细胞中的细菌III型分泌系统(T3SS)的必要组分。V-tip蛋白位于T3SS机构的最末端，且寡聚化被认为是效应分子跨靶细胞膜的功能性易位(translocalization)所必需的。OprI是铜绿假单胞菌和其他假单胞菌属物种的外膜脂蛋白。OprI在铜绿假单胞菌菌株中高度保守，因此代表假单胞菌属细菌的细胞表面靶向的优异的候选物。因此，需要靶向革兰氏阴性细菌的V-tip蛋白和细胞表面组分例如OprI的组合物和治疗。专利技术概述本公开文本提供结合革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的细菌V-tip蛋白(例如来自铜绿假单胞菌的PcrV)和/或细胞表面蛋白(例如铜绿假单胞菌的OprI蛋白)的分子(例如多肽，包括抗体、抗原结合性抗体片段、抗体样多肽和/或融合多肽)和组合物，以及在多种治疗、诊断和/或预防性适应症中制备和使用这些组合物的方法。本专利技术的V-tip蛋白靶向分子是单特异性的或多特异性的，并能以单价或多价方式结合其靶抗原。这些分子可用于结合和中和或以其他方式抑制革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的一种或多种细菌V-tip蛋白的至少一种生物活性。铜绿假单胞菌和其他耐药革兰氏阴性细菌是一个大的卫生问题，引起社区获得性感染和医院内感染。感染这样的细菌可为严重且致命的。一个重要的致病因子是3型分泌系统(T3SS)。革兰氏阴性细菌的T3SS造成毒素易位到真核细胞中，引起细胞死亡和溶解，从而使细菌建立感染。铜绿假单胞菌的PcrV是许多革兰氏阴性细菌T3SS所共同的V-tip蛋白的实例。V-tip蛋白位于T3SS机构的最末端，且寡聚化被认为是效应分子跨靶细胞膜的功能性易位所必需的。铜绿假单胞菌的PcrV对于注射效应分子(ExoS、ExoT、ExoU和ExoY)到真核细胞胞质溶质中是所需的，导致细胞死亡和溶解。铜绿假单胞菌的PcrV已显示是保护性抗原，表明靶向众多革兰氏阴性细菌的V-tip蛋白将提供有效的治疗选项。在一些实施方案中，V-tip蛋白靶向分子是抗体和抗体样分子，其特异性结合革兰氏阴性细菌的3型分泌系统(T3SS)机构的V-tip蛋白和阻断对真核细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，被称为V-tip蛋白结合蛋白(VPBP)的V-tip蛋白靶向抗体衍生自抗体或抗原结合性抗体片段，包括例如单链可变片段(scFv)、Fab片段、单域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在优选实施方案中，VPBP是人或人源化sdAb。sdAb片段可衍生自VHH、VNAR、工程改造的VH或VK结构域。VHH可产生自骆驼仅重链抗体。VNAR可产生自软骨鱼仅重链抗体。已应用各种方法从常规异二聚VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程(interfaceengineering)和选择特异性种系家族。在其他实施方案中，VPBP衍生自非抗体支架蛋白，例如但不限于设计的锚蛋白重复序列蛋白(darpin)、亲和体(avimer)、anticalin/脂质运载蛋白(lipocalin)、centyrin和fynomer。在优选实施方案中，V-tip蛋白是铜绿假单胞菌PcrV或衍生自铜绿假单胞菌PcrV，和VPBP特异性结合PcrV。在一些实施方案中，VPBP能够结合多种革兰氏阴性细菌的2种或更多种VPBP，至少包括来自铜绿假单胞菌的PcrV。在一些实施方案中，VPBP结合来自单一革兰氏阴性细菌物种的V-tip蛋白，例如来自铜绿假单胞菌的PcrV。在一些实施方案中，VPBP结合来自多于一种革兰氏阴性细菌物种的V-tip蛋白，至少包括来自铜绿假单胞菌的PcrV，并因而被认为是物种交叉反应性的。在一些实施方案中，V-tip蛋白靶向分子是融合蛋白。出乎意料地发现，增强VPBP的效价极大地增强在体外和体内免于铜绿假单胞菌的细胞保护功效。更出乎意料地发现，用单一多特异性融合蛋白中的不同VPBP靶向PcrV上两个不同表位产生甚至更大的免于由铜绿假单胞菌引起的细胞毒性的保护。后一发现结果甚至在个体的单特异性VPBP仅为弱保护性时也适用。事实上发现，当识别PCRV上不同表位的VPBP被掺入单一融合蛋白中时，与对于PCRV上的相同表位为多价的含VPBP融合蛋白相比或与两种分开的各自识别PCRV上不同表位的单特异性含VPBP融合蛋白的组合相比，它们在细胞保护方面更有效力。在一些实施方案中，本专利技术包含掺入有多于一个VPBP的融合蛋白，本文称为多价。在一些实施方案中，融合蛋白的VPBP识别靶V-蛋白上的相同表位，本文称为单特异性-多价。在其他实施方案中，融合蛋白的VPBP识别靶V-蛋白上的不同表位，本文称为多特异性-多价。在一些实施方案中，含VPBP融合蛋白包含两个VPBP，并具有对靶V-tip蛋白的二价结合能力。在一些实施方案中，含VPBP融合蛋白包含三个VPBP，并具有对靶V-tip蛋白的三价结合能力。在一些实施方案中，含VPBP融合蛋白包含四个VPBP，并具有对靶V-tip蛋白的四价结合能力。在一些实施方案中，含VPBP融合蛋白包含六个VPBP，并具有对靶V-tip蛋白的六价结合能力。在一些实施方案中，含VPBP融合蛋白包含八个VPBP，并具有对靶V-tip蛋白的八价结合能力。在这些实施方案中，掺入到本专利技术融合蛋白中的VPBP可为单特异性的或多特异性的。一般地，本专利技术融合蛋白由经接头多肽有效连接的至少两个或更多个VPBP构成。在本专利技术融合蛋白中使用sdAb片段作为特异性VPBP具有避免许多双/多特异性抗体方法所共有的重链:轻链错误配对问题的益处。此外，本专利技术融合蛋白避免使用许多双特异性抗体所必需的长接头。此外，本专利技术融合蛋白大小(大约75~125kDa)通常小于常规抗体。与常规抗体相比，该减小的分子量可使得能够更好地穿透到感染位点中。在一些实施方案中，本专利技术融合蛋白由单一多肽组成。在其他实施方案中，本专利技术融合蛋白由多于一个多肽组成。例如，其中异二聚化结构域被掺入到融合蛋白中以构建不对称融合蛋白。例如，如果免疫球蛋白Fc区被掺入到融合蛋白中，CH3结构域可用作均二聚化结构域，或CH3二聚体界面区可突变以实现异二聚化。在一些实施方案中，融合蛋白在相对的末端含有VPBP。例如，VPBP既位于融合蛋白的氨基末端(N末端)部分，又位于融合蛋白的羧基末端(C末端)部本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其结合革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的至少一种细菌V‑tip蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.01 US 62/155967;2015.11.13 US 62/2549921.一种分离的多肽，其结合革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的至少一种细菌V-tip蛋白。2.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽是单特异性的。3.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽是多特异性的。4.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽是双特异性的。5.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是抗体或其抗原结合片段。6.权利要求5的分离的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv、Fab、单域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。7.权利要求5的分离的多肽，其中所述抗体或抗原结合片段是sdAb。8.权利要求7的分离的多肽，其中所述sdAb是人或人源化sdAb。9.权利要求7的分离的多肽，其中所述sdAb是VHH、VNAR、工程改造的VH结构域或工程改造的VK结构域。10.权利要求5的分离的多肽，其中所述抗体或其抗原结合片段包含第一V-tip蛋白结合蛋白(VPBP1)和第二V-tip蛋白结合蛋白(VPBP2)。11.权利要求10的分离的多肽，其中所述VPBP1和VPBP2结合相同的V-tip蛋白。12.权利要求11的分离的多肽，其中所述VPBP1和VPBP2结合相同V-tip蛋白上的相同表位。13.权利要求11的分离的多肽，其中所述VPBP1和VPBP2结合相同V-tip蛋白上的不同表位。14.权利要求10的分离的多肽，其中所述VPBP1和VPBP2结合不同的V-tip蛋白。15.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。16.权利要求15的分离的多肽，其中所述融合蛋白包含第一V-tip蛋白结合结构域(VPBD1)和第二V-tip蛋白结合结构域(VPBD2)。17.权利要求15的分离的多肽，其中所述VPBD1和VPBD2结合相同的V-tip蛋白。18.权利要求17的分离的多肽，其中所述VPBD1和VPBD2结合相同V-tip蛋白上的相同表位。19.权利要求17的分离的多肽，其中所述VPBD1和VPBD2结合相同V-tip蛋白上的不同表位。20.权利要求15的分离的多肽，其中所述VPBP1和VPBP2结合不同的V-tip蛋白。21.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其中革兰氏阴性细菌的III型分泌系统的V-tip蛋白是来自铜绿假单胞菌的PcrV。22.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含选自SEQIDNO:10-44、71-74和81-84的氨基酸序列。23.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含异二聚化结构域。24.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含免疫球蛋白Fc区多肽。25.权利要求24的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白Fc区多肽包含选自SEQIDNO:1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：A霍兰兹，JC蒂默，Q德韦劳瓦，BP埃克尔曼，
申请(专利权)人：英伊布里克斯有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：美国,US