抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述应用为所述纳米抗体在制备抗绿脓杆菌外毒素A药物中的应用。本发明专利技术提供的抗绿脓杆菌外毒素A纳米抗体对绿脓杆菌外毒素A具有特异的识别和结合能力，并且能够有效中和绿脓杆菌外毒素A的毒性作用，从而对正常细胞起到保护作用。

Nano antibody to Pseudomonas exotoxin A and its application

The invention discloses an application of nano antibody and anti Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, the nano antibody has a unique 3 complementarity determining region CDR1, CDR2, CDR3, the application of the nanometer antibody in preparing anti Pseudomonas exotoxin A application in medicine. Identification of resistance of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A nano antibody having specific to Pseudomonas exotoxin A provided by the invention and binding capacity, and can effectively neutralize the toxic effect of Pseudomonas exotoxin A, thus protecting the normal cells.

【技术实现步骤摘要】
抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用
本专利技术公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。
技术介绍
绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(学名Pseudomonasaeruginos′)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。绿脓杆菌是1882年首先由Gersard氏从伤口脓液分离得到。该菌在自然界广泛存在于水、土壤、空气以及动物的肠道和皮肤中，为一种条件性致病菌，在特定的情况下能引起人及动物感染发病。1972年，P.v.Liu在临床分离株的培养液中，发现了导致绿脓杆菌感染的毒性因子——外毒素A，并指出绿脓杆菌外毒素A(PseuduomonasExotoxinA，PE)对皮肤黏膜有坏死作用，进入血液中能诱发败血症。在脏器组织细胞中，绿脓杆菌外毒素A与白喉毒素类似，具有阻碍蛋白质合成的作用；对小鼠和大鼠感受性高，具有致死作用，对培养细胞有“细胞崩坏毒性”。绿脓杆菌外毒素A的毒性非常强，能够对机体组织及器官造成极大危害，甚至能够破坏角膜基质细胞。为了探讨有效控制和治疗绿脓杆菌外毒素A相关疾病的方法，对绿脓杆菌外毒素A的生物学特性及其致病性的研究也越来越多。已有的研究成果表明，绿脓杆菌外毒素A是一个66kD的单链毒素蛋白，它具有三个结构域，其中Ia区主要负责细胞的识别，使PE与靶细胞结合；Ⅱ区是转位区，使之能够进人细胞浆；Ⅲ区是活性区，催化延长因子2(ElongationFactor2，EF2))ADP核糖基化，导致Ef2失活，阻碍蛋白合成，最终导致细胞死亡；Ib区功能至今不明，但是大部分氨基酸的缺失不影响其毒素分子的活性。PE是目前已知最有效的细胞毒素之一，由于其集细胞结合、转位及酶活性三种功能于一身，因此比其他毒素更适合于基因改造，从而达到构建重组免疫毒素的要求。经改构的缺失细胞识别区的PE是目前最常用的毒素蛋白之一，其可通过抑制细胞蛋白质合成，发挥损伤和杀死细胞的作用。由于上述特性，将PE与特定的载体结合(如单克隆抗体、细胞因子等)组成相应的免疫毒素，可用于肿瘤的靶向治疗研究。基于PE毒素在临床病理学所表现出的突出特性以及在临床治疗领域特别是肿瘤治疗上作为免疫毒素组成部分所具有的巨大应用前景，研发出针对PE毒素的特异性中和抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原和毒素难以达到理想的结合和中和效果。1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(HeavychainonlylikeAntibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。本专利技术的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗PE毒素的纳米抗体，并进一步提供其在PE毒素检测和在制药学领域中的应用。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，(1)CDR1序列由SEQIDNO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.3所述氨基酸序列组成，或者(2)CDR1序列由下述氨基酸序列组成:由SEQIDNO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.9所述氨基酸序列组成，或者(3)CDR1序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.15所述氨基酸序列组成。在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列(1)由SEQIDNO.4所述氨基酸序列组成，或者(2)由SEQIDNO.10所述氨基酸序列组成，或者(3)由SEQIDNO.16所述氨基酸序列组成。在一个更为优选的技术方案呢中，所述纳米抗体还具有恒定区，所述纳米抗体的恒定区序列(1)由SEQIDNO.5所述氨基酸序列组成，或者(2)由SEQIDNO.11所述氨基酸序列组成，或者(3)由SEQIDNO.17所述氨基酸序列组成。第二，本专利技术还提供了一种编码权利要求3所述纳米抗体序列的核苷酸编码序列，所述编码序列由SEQIDNO.6所示，或者由SEQIDNO.12所示，或者由SEQIDNO.18所示。第三，本专利技术提供了一种含有上述核苷酸编码序列的表达载体。在一个优选的技术方案中，所述载体为pMES4。第四，本专利技术提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在一个优选的技术方案中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。第五，本专利技术还提供了上述的纳米抗体在制备制备抗PE毒素药物中的应用。最后，本专利技术提供了一种纳米抗体的组合物，所述组合物含有下述纳米抗体的一种或多种，可变区由SEQIDNO.4所示氨基酸序列的纳米抗体、或者由SEQIDNO.10所示氨基酸序列的纳米抗体，和/或由SEQIDNO.16所示氨基酸序列的纳米抗体。本专利技术提供的抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，由于具有独特的CDR1、2和3区序列，使所述抗体对绿脓杆菌外毒素A抗原具有特异的识别和结合能力。筛选的两株纳米抗体亲和力均达到10-8，且两株纳米抗体分别为与抗原结合速度最快与解离速度最慢的抗体，显示出本专利技术提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。本专利技术提供的纳米体还显示了在中和毒素方面中的应用。在本专利技术的实施例中，所述纳米抗体具有显著的中和毒素及保护细胞的效应，能够有效降低PE毒素对细胞的抑制率，从而起到保护细胞的作用。附图说明图1.重组PE免疫毒素载体质粒双酶切鉴定图；图2.重组PE免疫毒素表达纯化S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗PE毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，(1)CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成，或者(2)CDR1序列由SEQ ID NO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.9所述氨基酸序列组成，或者(3)CDR1序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.14所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.15所述氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种抗PE毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，(1)CDR1序列由SEQIDNO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.3所述氨基酸序列组成，或者(2)CDR1序列由SEQIDNO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.9所述氨基酸序列组成，或者(3)CDR1序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.15所述氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列(1)由SEQIDNO.4所述氨基酸序列组成，或者(2)由SEQIDNO.10所述氨基酸序列组成，或者(3)由SEQIDNO.16所述氨基酸序列组成。3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，黄琪，古一，李飞，周宇航，王欢，李靖婵，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44