用于产生甜菊醇糖苷的发酵方法技术

公开了用于使用工程化酵母产生甜菊醇糖苷诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的方法。所述方法包括使酵母在非发酵碳源上生长。其他方法包括使酵母在一种或多种多糖上生长，其中所述多糖的糖化和发酵同时发生。

Fermentation method for producing stevioside

A method for producing steviolol glycosides, such as lebraid D and LeBron M, is disclosed for using engineered yeast. The method includes the growth of yeast on a non fermented carbon source. Other methods include making yeast growing on one or more polysaccharides, in which the saccharification and fermentation of the polysaccharides occur simultaneously.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生甜菊醇糖苷的发酵方法本申请要求于2015年8月6日提交的标题为“FermentationMethodsforProducingSteviolGlycosides”的美国临时申请No.62/201,941的权益，该临时申请的全部内容以引用方式并入本文。于2015年5月7日创建的且大小为95千字节的标题为“CAR0217P1_Sequence_Listing.txt”的ASCII文本文件的全部内容整体以引用方式并入本文。于2016年8月6日创建的CAR0217WOSequenceListing.txt也与此一并提交并以引用方式并入本文。
技术介绍
糖类诸如蔗糖、果糖和葡萄糖用于为饮料、食品、药品和口腔卫生产品/美容产品提供令人愉悦的口感。尤其是蔗糖赋予消费者偏爱的口感。虽然蔗糖提供优良的甜味特征，但是它是含热量的。已引入无热量或低热量的甜味剂来满足消费者的需求，并且期望具有有利味道特征的这些类型的甜味剂。甜菊是属于向日葵家族(菊科)的大约240种草本和灌木的属，原产自从北美洲西部到南美洲的亚热带和热带地区。甜叶菊(Steviarebaudiana)(通常称为甜叶、糖叶或简称甜菊)这个种被广泛种植以用于获取其甜叶。基于甜菊的甜味剂可以通过从叶子中提取一种或多种甜味化合物而获得。这些化合物中的许多是甜菊醇糖苷，它们是甜菊醇(一种二萜化合物)的糖苷。这些二萜糖苷比糖甜约150至450倍。甜菊醇糖苷的实例在WO2013/096420(参见例如图1中的列表)以及在Ohta等人“CharacterizationofNovelSteviolGlycosidesfromLeavesofSteviarebaudianaMorita，”J.Appl.Glycosi.，57，199-209(2010)(参见例如第204页的表4)中进行了描述。在结构上，二萜糖苷的特征在于单一基础结构即甜菊醇，并且差别在于在C13和C19位存在碳水化合物残基，如图2a-2k中所展示。另见PCT专利公布WO20013/096420。通常，基于干重，在甜菊的叶子中发现的四种主要甜菊醇糖苷是杜尔可苷A(0.3％)、莱苞迪苷C(0.6-1.0％)、莱苞迪苷A(3.8％)和甜菊苷(9.1％)。甜菊提取物中鉴定的其他糖苷包括莱苞迪苷B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、甜菊醇二糖苷和甜茶苷中的一种或多种。虽然主要的甜菊醇糖苷RebA通常在饮料应用中用作甜味剂，但是它具有异味问题。最近，人们一直关注某些具有更好的味道特性的次要甜菊醇糖苷。例如，莱苞迪苷M具有较高的甜味强度，并且比其他甜菊醇糖苷更有效(例如参见Prakash，I.等人(2013)Nat.Prod.Commun.，8:1523–1526和WO2013/096420)。莱苞迪苷D的味道比蔗糖甜约200-220倍，在感官评价中它具有缓慢发生的甜度，并且非常纯正(例如参见Prakash，I.等人(2012)Int.J.Mol.Sci.，13:15126-15136)。已经使用分子技术来制备能够经由发酵来合成甜菊醇糖苷的重组生物。例如，具有多个编码甜菊醇糖苷合成中涉及到的酶的转基因的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的重组菌株已被用于产生莱苞迪苷M和莱苞迪苷D(参见例如WO2014/222227)。酿酒酵母通常在培养基中存在>1-2g/l葡萄糖的情况下发酵(反巴士德效应)。当这种效应发生时，乙醇作为发酵产物而产生。乙醇的产生减少生物质和期望的生物产物(例如甜菊醇糖苷)。将葡萄糖保持为限制性的和/或使用不刺激反巴士德效应的底物的一种方法可以是使用可支持甜菊醇糖苷产生的非发酵底物。另一种限制葡萄糖释放并使葡萄糖水平低于刺激酵母发酵的水平的方法是应用同步糖化和发酵(SSF)。
技术实现思路
公开了通过使酵母在非发酵底物上生长来产生甜菊醇糖苷的方法。还公开了通过同步糖化和发酵使酵母生长来产生甜菊醇糖苷的方法。根据一个方面，用于产生甜菊醇糖苷的方法包括：使能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在葡萄糖限制性培养基中生长，该培养基包含可由该工程化酵母发酵的碳水化合物。可发酵碳水化合物的低于50重量％(wt％)、优选<20wt％、更优选<10wt％或<5wt％为葡萄糖和/或果糖，即葡萄糖、果糖或葡萄糖和果糖。在一些方面，葡萄糖和/或果糖可占可发酵碳水化合物的低于2wt％、优选<1wt％，并且在一个有用的方面，葡萄糖限制性培养基基本上不含葡萄糖。可发酵碳水化合物的至少50wt％、优选至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、甘油及其组合，优选地选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖及其组合，更优选地选自棉子糖、甘露糖、海藻糖及其组合。另一方面，用于产生甜菊醇糖苷的方法包括：(a)提供能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母和具有一种或多种多糖和/或一种或多种寡糖的碳源；(b)将所述一种或多种多糖和/或一种或多种寡糖的至少一部分转化成一种或多种单糖；以及(c)使所述工程化酵母在所述一种或多种单糖上生长以产生一种或多种甜菊醇糖苷。具体实施方式本文描述的本公开的实施方案无意为穷尽性的或将本专利技术限制于以下详细描述中所公开的精确形式。相反，所选和所述的实施方案的目的是使得可便于本领域的技术人员认识和理解本专利技术的原理和实践。本公开的发酵方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可以包含编码促进细胞中一种或多种甜菊醇糖苷形成的酶的一种或多种外源核酸。如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G、莱苞迪苷H、莱苞迪苷I、莱苞迪苷J、莱苞迪苷K、莱苞迪苷L、莱苞迪苷M、莱苞迪苷N、莱苞迪苷O、甜菊苷、甜菊醇二糖苷、杜尔可苷A和甜茶苷。工程化酵母可以产生与自然界中发现的(“天然存在的”)甜菊醇糖苷相同的甜菊醇糖苷以及不知道存在于甜叶菊叶子中的甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷可以通过酶促过程在工程化酵母中形成。在结构上，根据下面所示基础结构上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(其为单一甜菊醇基础结构)以及附连至甜菊醇基础结构的C13和/或C19原子的吡喃葡萄糖基残基。也就是说，吡喃葡萄糖基残基代表下式中的基团R2和R1：根据本公开，甜菊醇糖苷是在具有至少两个阶段的过程中产生的：第一阶段和第二阶段，其中将含有葡萄糖的补料组合物在各阶段以不同的补料模式提供给培养基，诸如可变补料然后恒定补料。如本文所述的两阶段补料过程可导致第二阶段比第一阶段的生长速率更慢，并因此增加甜菊醇糖苷产生速率、减少发酵时间并降低生物质浓度。工程化酵母可以具有提供合成甜菊醇糖苷的途径的一组酶。例如，该过程可以产生甜菊醇糖苷，诸如RebM和RebD。本公开的方法可以使用经工程改造以提供一种或多种甜菊醇糖苷的途径的各种酵母宿主细胞。此类细胞可以用编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种DNA构建体转化。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源DNA构建体的宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括使能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在葡萄糖限制性培养基中生长，所述葡萄糖限制性培养基包含可由所述工程化酵母发酵的碳水化合物，其中a.所述葡萄糖限制性培养基中的所述可发酵碳水化合物的低于50重量％(wt％)、优选低于20wt％、更优选低于10wt％或低于5wt％是葡萄糖、果糖或葡萄糖和果糖；并且b.所述葡萄糖限制性培养基中的所述可发酵碳水化合物的至少50wt％、优选至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％是选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、甘油及其组合的乙醇限制性底物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 US 62/201,9411.一种用于产生甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括使能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母在葡萄糖限制性培养基中生长，所述葡萄糖限制性培养基包含可由所述工程化酵母发酵的碳水化合物，其中a.所述葡萄糖限制性培养基中的所述可发酵碳水化合物的低于50重量％(wt％)、优选低于20wt％、更优选低于10wt％或低于5wt％是葡萄糖、果糖或葡萄糖和果糖；并且b.所述葡萄糖限制性培养基中的所述可发酵碳水化合物的至少50wt％、优选至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％是选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、甘油及其组合的乙醇限制性底物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述乙醇限制性底物选自棉子糖、甘露糖、海藻糖、半乳糖及其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述乙醇限制性底物选自棉子糖、甘露糖、海藻糖及其组合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷包括莱苞迪苷M、莱苞迪苷D或莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化酵母包括念珠菌属、克勒克酵母属(汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉森酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。6.根据权利要求1所述的方法，其中所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的至少50wt％在细胞外释放。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷包括莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者，...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·安德森，T·L·卡尔松，A·M·福斯美尔，
申请(专利权)人：嘉吉公司，
类型：发明
国别省市：美国,US