一种烟酰胺的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种烟酰胺的生产工艺，该生产工艺包括：基因工程菌的构建，工程菌的发酵培养以及催化反应；所述工程菌包括大肠杆菌宿主细胞和碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的腈水合酶基因；所述催化的过程包括：以纯水为反应介质，制得细胞悬液；向细胞悬液中分批加入3‑氰基吡啶，控制反应体系中3‑氰基吡啶的浓度≤90g/L，得到烟酰胺。本发明专利技术工艺采用含高酶活的重组腈水合酶的基因工程菌进行发酵培养，并以纯水为反应介质，采用分批投加底物的方式向细胞悬液中添加3‑氰基吡啶，实现高效地水合反应，得到烟酰胺产品；该工艺中水合反应的转化率＞99.9％，获得的产品品质高，且无杂质和副产物产生。

A production process of nicotinamide

The invention discloses a production process of nicotinamide, including the production process: Construction of gene engineering bacteria, fermentation engineering bacterium and catalytic reaction; nitrile water Escherichia coli host cells and nucleotide sequences such as SEQ ID or SEQ NO.1 ID shown in the NO.2 synthase gene including the engineering bacteria; the catalytic process includes: using pure water as reaction medium, prepared cell suspension; the cell suspension was added in batches of 3 cyanopyridines, control in the reaction system of 3 cyanopyridines concentration less than 90g/L by nicotinamide. The process of the invention using gene engineering bacteria containing recombinant high nitrile hydratase activity of the fermentation, and using pure water as reaction medium, batch adding substrate liquid added 3 way cyanopyridines to cell suspension, efficiently hydration, hydration products by nicotinamide; in the process of conversion > 99.9%, the product quality is high, and no impurities and by-products.

【技术实现步骤摘要】
一种烟酰胺的生产工艺
本专利技术属于生物化工领域，尤其涉及一种烟酰胺的生产工艺。
技术介绍
烟酰胺又名尼克酰胺，英文名称：Nicotinamide，烟酰胺又称为维生素B3，属于B族维生素(Vb)，是生物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II)的组成部分，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢过程。烟酰胺作为维生素具有抗粗皮肤病的作用，对某些皮肤病和神经障碍有独特疗效。烟酰胺的最大应用领域是作为饲料添加剂，同时也可以添加到食品中用以补充人体所需的维生素。研究发现，在饲料中添加烟酰胺或烟酸可以提高畜禽的抗病能力和生长速率。烟酰胺也是合成某些医药、农药的重要中间体。目前，全球烟酰胺和烟酸的总生产能力近6万t/年，随着饲料工业的发展，烟酰胺的市场需求正以每年4％～5％的速度快速增长。同时，随着生活水平的不断进步，人们对饮食水平提出更高的要求，作为维生素的烟酰胺将得到更广泛的应用。主流生产烟酰胺的方法是利用腈水合酶催化3-氰基吡啶生产烟酰胺。瑞士龙沙(Lonza)集团在中国广州南沙市建立的一条年产9000吨的烟酰胺生产线，采用产腈水合酶的野生菌种R.RhodochrousJ1的细胞作为催化剂，应用细胞固定化技术进行生产。但野生菌生产烟酰胺往往会会有副产物烟酸的产生，导致烟酰胺产品质量不高；此外，目前生物法生产烟酰胺的反应液杂质多、产品浓度不高，导致后续精制工艺复杂、能耗高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种烟酰胺的生产工艺，该生产工艺制备获得的烟酰胺产品浓度高、杂质少，得率高。具体技术方案如下：一种烟酰胺的生产工艺，包括：重组腈水合酶基因工程菌的构建，所述工程菌的发酵培养以及利用所述工程菌催化3-氰基吡啶得到烟酰胺；其特征在于：所述重组腈水合酶基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述目的基因为碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的腈水合酶基因；所述催化的过程包括：(1)以水为溶剂，重悬所述工程菌，制得细胞悬液；(2)向所述细胞悬液中分批加入底物3-氰基吡啶，控制反应体系中3-氰基吡啶的浓度≤90g/L，进行水合反应，得到产物烟酰胺。具体的，本专利技术以两种菌株为例，即：表达博得特氏菌DSM12804(BordetellapetriiDSM12804)来源腈水合酶的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP；以及表达锰氧化橙单胞菌SI859A(AurantimonasmanganoxydansSI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229。上述重组腈水合酶基因工程菌中的重组腈水合酶分别来源于博得特氏菌(Bordetellapetrii)DSM12804和锰氧化橙单胞菌(Aurantimonasmanganoxydans)SI859A；重组腈水合酶基因的碱基序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，工程菌采用大肠杆菌E.coliBL21(DE3)作为宿主菌，以pET-30a(+)作为载体。本专利技术工艺所涉及的腈水合酶是在大肠杆菌中表达的胞内酶，为了高效、大规模地获取表达腈水合酶的大肠杆菌细胞，同时利用基因工程菌具有精确的基因开关的特点，我们将发酵过程分为两个阶段、分别加以控制：即细胞快繁阶段和产酶阶段。作为优选，所述发酵培养的过程包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵；所述补料分批发酵的过程包括：(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH4Cl和0.6g/LMgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。其中，在细胞快繁阶段，采用指数流加方式连续补加补料培养基，使基因工程菌以一恒定的比生长速率快速生长；而在产酶阶段，采用恒速流加的方式继续连续补加补料培养基，使基因工程菌的主要生理代谢活动适合腈水合酶的高效表达，这一阶段菌体快速生长和繁殖虽然较为缓慢、但并未停止，从而进一步提高发酵密度。大肠杆菌发酵最适温度是37℃，最适pH6.8～7.2，当条件最适菌体生长时，大肠杆菌很快就会进入指数生长期。当基础培养基营养物质被耗尽后，生长进入衰亡期，但如果在基础培养基营养物质被耗尽前流加营养物质(补料培养基)，大肠杆菌的指数生长期会大大延长，从而获得高细胞密度。然而，随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加，这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降，但同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。因此，降低温度、降低比生长速率，更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。作为优选，步骤(1)中，所述温度为32～35℃，溶氧量为20～30％；步骤(2)中，所述温度为18～20℃，溶氧量为30～50％。作为优选，步骤(1)中，控制所述基因工程菌的比生长速率为0.2～0.3；步骤(2)中，控制所述基因工程菌的比生长速率0.01～0.04。作为优选，步骤(1)中，以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5～15％。作为优选，步骤(2)中，以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量为5～15g/L。作为优选，步骤(1)中，发酵培养的时间为8～16h；步骤(2)中，发酵培养的时间为48～96h。作为优选，所述菌种活化的过程，包括：将基因工程菌菌株接种至固体培养基上进行活化培养；所述活化培养的温度为35～37℃，时间为8～16h；所述固体培养基为：LB-Kan固体培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH7.0，20g/L琼脂粉，卡那霉素浓度为50μg/mL。作为优选，所述种子培养的过程，包括：将活化后的菌种接种至一级种子培养基中，进行一级培养；再接种至二级种子培养基中进行二级培养；所述一级培养的温度为35～37℃，时间为8～24h；所述二级培养的温度为35～37℃，时间为3～12h。作为优选，所述一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟酰胺的生产工艺，包括：重组腈水合酶基因工程菌的构建，所述工程菌的发酵培养以及利用所述工程菌催化3‑氰基吡啶得到烟酰胺；其特征在于：所述重组腈水合酶基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的腈水合酶基因；所述催化的过程包括：(1)以水为溶剂，重悬所述工程菌，制得细胞悬液；(2)向所述细胞悬液中分批加入底物3‑氰基吡啶，控制反应体系中3‑氰基吡啶的浓度≤90g/L，进行水合反应，得到产物烟酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺的生产工艺，包括：重组腈水合酶基因工程菌的构建，所述工程菌的发酵培养以及利用所述工程菌催化3-氰基吡啶得到烟酰胺；其特征在于：所述重组腈水合酶基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述目的基因为碱基序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的腈水合酶基因；所述催化的过程包括：(1)以水为溶剂，重悬所述工程菌，制得细胞悬液；(2)向所述细胞悬液中分批加入底物3-氰基吡啶，控制反应体系中3-氰基吡啶的浓度≤90g/L，进行水合反应，得到产物烟酰胺。2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述发酵培养的过程包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵；所述补料分批发酵的过程包括：(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH4Cl和0.6g/LMgSO4，卡那霉素浓度为50μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立荣，周海胜，吴坚平，徐刚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33