本发明专利技术提供一种同时定量检测末梢全血中烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，主要由末梢全血采集所需干血片(Whatman protein saver 903)，毛细采血管，烟酸、烟酰胺和泛酸维生素标准品及其同位素内标，三氯乙酸组成，还包括干血点制备、干血点前处理和检测步骤。本发明专利技术提供的烟酸、烟酰胺、泛酸干血点定量试剂盒，将干血点采样技术与高效液相色谱‑串联质谱技术联合用于B族维生素定量，一次微创，微量的血液采集同时实现对多种B族维生素营养状况的评估，能够实现代谢酶依赖法、免疫分析法所无法完成的低样本量条件下同时检测多种维生素的定量工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属维生素定量检测领域，尤其是一种同时定量检测全血干血点中烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒。
技术介绍
泛酸(VB5)，烟酸(VB3)，烟酰胺均为小分子量的B族维生素，在人体内含量很低，但对机体正常生理功能的维持至关重要。烟酸(VB3)和烟酰胺通过形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)参与细胞代谢的中心电子传递及氢转移，至少参与200多个碳水化合物、脂肪酸及氨基酸代谢反应。泛酸(VB5)是辅酶A(CoA)的必须成分，而CoA与乙酸形成的乙酰CoA是三大物质代谢的关键因子，且在蛋白质的酰化作用中也具有重要作用。因为VB3,VB5在细胞代谢中的广泛作用，其缺乏或不足均会引起特殊的缺乏综合症，维持其最佳营养状态至关重要。B族维生素营养评估可以在维生素缺乏早期(储存维生素动员期或在明显的营养缺乏症状出现之前)发现维生素的亚最佳营养状态。因为维生素缺乏症在早期阶段很容易纠正，且维生素早期缺乏人群与已有显著的维生素缺乏综合症人群相比，人数更多，因此，维生素营养评估对人群健康非常有价值。应用最广泛的维生素营养评估方法是维生素依赖酶的活性测定，例如测定红细胞磺胺乙酰基转移酶活性评估泛酸的含量。维生素依赖酶活性测定虽然可以估量实际代谢情况并间接反映体内维生素是否缺乏，但一次代谢物酶活性测 定，只反映一种维生素的状况，由于不能同时检测多种维生素含量，且代谢酶活性易受到遗传多态性的影响，限制了其在人群维生素营养评估中的广泛应用，目前通常作为实验室检查辅助医生诊断维生素缺乏症。体液(全血，血浆，血清，尿液)中B族维生素水平定量可以直接反应机体维生素营养状况，其中血浆/血清基质中含有新近吸收及正在转运至各组织的维生素，更多的反应近期的维生素摄入水平，检测结果易受膳食影响。全血基质中红细胞的半衰期为120天，因此相较于血清/血浆，全血或红细胞更能反应长期的维生素营养状况。高效液相色谱－串联质谱法(LC-MS/MS)是近年来被广泛应用的复杂基质中痕量物质定量的方法，与传统的维生素依赖酶活性测定及免疫分析的方法相比，LC-MS/MS的方法不仅可以直接反应维生素的水平，而且可以实现对多种维生素同时定量。既往文献中LC-MS/MS多用于血清、血浆、尿液或食物中VB3或VB5定量，目前尚未有应用LC-MS/MS方法同时检测全血基质中VB3和VB5水平的研究报道。主要原因如下，首先因为细胞为代谢的场所，因此全血基质与不含细胞的血浆/血清基质相比，基质背景更为复杂，对样品的前处理要求较高。其次，VB3(烟酸、烟酰胺)，泛酸均为极性化合物，在传统的反相色谱柱上保留能力较弱，分离效果差，虽然质谱的多反应监测模式不依赖保留时间定性，但良好的分离会减少与目标维生素共流出的内源性干扰物，最大限度地减少基质效应，进而保证定量结果的准确。干血点采样技术(DBS)，即将末梢全血采集于滤纸片上，与传统静脉采血相比，具有微创，储存运输方便及对采血人员专业技术水平要求低等多种优势，非常适合用于大范围人群维生素营养状况评估时的血样采集，尤其适用于当地不具备维生素定量检测设备，需要转运标本的边远地区。DBS与LC－MS/MS 技术联用在小分子定量分析中已经成为一个重要的方法，但在维生素定量领域，目前国内外均没有应用DBS结合LC－MS/MS技术进行B族维生素定量的报道。除了液态全血中需要解决的样品前处理与分离问题，全血干血点由于采集的全血量很少(50μ)，还容易出现待测维生素不能满足检测定量限进而不能定量的情况。
技术实现思路
本专利技术提供一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，本试剂盒应用DBS结合同位素稀释LC－MS/MS技术，采用三氯乙酸水溶液超声萃取的前处理方法，可同时定量极微量全血样本中烟酸、烟酰胺及泛酸等B族维生素。本专利技术的
技术实现思路
为一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，主要由末梢全血采集所需干血片(Whatman protein saver 903)，毛细采血管，烟酸、烟酰胺和泛酸维生素标准品及其同位素内标，三氯乙酸组成，还包括干血点制备、干血点前处理和检测步骤，其中：干血点制备，用毛细采血管采集50μL血液于末梢全血采集所需干血片上，暗处静置阴干制成干血点，密封保存；干血点前处理，取干血点，加入由同位素内标配置的内标溶液和有三氯乙酸配置的溶液，涡旋并使液面浸泡过干血点，避光超声提取，涡旋震荡，离心处理，制成待检测溶液；检测步骤，取部分带检测溶液，进行LC-MS/MS分析。所述的维生素标准品为：氘代烟酸(Nicotinic-d4，CAS号：66148-15-0，纯度：98％)，氘代烟酰胺(Nicotinamide-d4)，13C,15N代泛酸(B5-[13C6,15N2]，CAS号：137-08-6，纯度：>97％)。所述的同位素内标为：氘代烟酸，CAS号：66148-15-0，纯度98％；氘代烟酰胺；13C,15N代泛酸，CAS号：137-08-6，纯度>97％。标准溶 液的配置过程如下：称取适量的烟酸，烟酰胺，泛酸标准品，加入50g/L三氯乙酸溶解，分别配制得到浓度为150μg/mL，700μg/mL，400μg/mL的烟酸、烟酰胺、泛酸标准溶液储备液，储存于-20℃冰箱中；用50g/L三氯乙酸分别将以上述三种溶液储备液配制成浓度为5μg/mL的二级溶液，然后再使用3种二级溶液配制得到烟酸/烟酰胺/泛酸浓度分别为0.5/2/1，1/4/2，2.5/10/5，5/20/10，25/100/50，50/200/100，80/320/160，100/400/200ng/mL的标准溶液工作液混合液和1.5/6/3，30/120/60，75/300/150ng/mL的质控溶液混合液，储存于-20℃。内标溶液的配置过程如下：称取适量的氘代烟酸，氘代烟酰胺，13C,15N代泛酸，加入50g/L三氯乙酸溶解，分别配制得到浓度为160μg/mL，90μg/mL，135μg/mL的氘代烟酸，氘代烟酰胺，13C,15N代泛酸标准溶液储备液，储存于-20℃冰箱中；取上述内标标准溶液储备液配制成氘代烟酸，氘代烟酰胺，13C,15N代泛酸浓度为50/100/100ng/mL的内标工作溶液，储存于-20℃冰箱中。所述的干血点制备具体为，用75％酒精棉片消毒手指指腹，待酒精挥干后，用一次性采血针刺破皮肤，用毛细采血管采集50μL全血滴于DBS卡片上，暗处静置1-2小时阴干后置于避光密封袋内保存。所述的干血点前处理和检测步骤具体为，取干血点，分别加入内标溶液50μL，200g/L三氯乙酸水溶液450μL，涡旋并使液面浸泡过干血片，避光超声提取30min，涡旋震荡5min，13000rpm离心5min，取40μL进行LC-MS/MS分析。其中包括色谱纯级别甲酸，分析纯三氯乙酸，C8反相色谱柱(ACE，4.6*100mm)。本试剂盒适用于液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，电喷雾(ESI)源正离子多反映监测(MRM)模式,母离子，子离子，去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)、 碰撞室射出电压(CXP)等质谱参数见表1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，主要由末梢全血采集所需干血片，毛细采血管，烟酸、烟酰胺和泛酸维生素标准品及其同位素内标，三氯乙酸组成，其特征在于：还包括干血点制备、干血点前处理和检测步骤，其中：干血点制备，用毛细采血管采集50μL末梢全血于干血片上，暗处静置阴干制成干血点，密封保存；干血点前处理，取干血点，加入由同位素内标配置的内标溶液和有三氯乙酸配置的溶液，涡旋并使液面浸泡过干血点，避光超声提取，涡旋震荡，离心处理，制成待检测溶液；检测步骤，取部分待检测溶液，进行LC‑MS/MS分析。
【技术特征摘要】
1.一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，主要由末梢全血采集所需干血片，毛细采血管，烟酸、烟酰胺和泛酸维生素标准品及其同位素内标，三氯乙酸组成，其特征在于：还包括干血点制备、干血点前处理和检测步骤，其中：干血点制备，用毛细采血管采集50μL末梢全血于干血片上，暗处静置阴干制成干血点，密封保存；干血点前处理，取干血点，加入由同位素内标配置的内标溶液和有三氯乙酸配置的溶液，涡旋并使液面浸泡过干血点，避光超声提取，涡旋震荡，离心处理，制成待检测溶液；检测步骤，取部分待检测溶液，进行LC-MS/MS分析。2.根据权利要求1所述的一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，其特征在于：所述的维生素标准品为：烟酸，CAS号：59-67-8，纯度≥99.5％；烟酰胺，CAS号：98-92-0，纯度≥99.5％)；泛酸，CAS号：P5155。3.根据权利要求1所述的一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，其特征在于：所述的同位素内标为：氘代烟酸，CAS号：66148-15-0，纯度98％；氘代烟酰胺；13C,15N代泛酸，CAS号：137-08-6，纯度>97％。4.根据权利要求2所述的一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒，其特征在于：还包括由维生素标准品配置成标准溶液，标准溶液的配置过程如下：称取适量的烟酸，烟酰胺，泛酸标准品，加入50g/L三氯乙酸溶解，分别配制得到浓度为150μg/mL，700μg/mL，400μg/mL的烟酸、烟酰胺、泛酸标准溶液储备液，储存于-20℃冰箱中；用50g/L三氯乙酸分别将以上述三种溶液储备液
\t配制成浓度为5μg/mL的二级溶液，然后再使用3种二级溶液配制得到烟酸/烟酰...
【专利技术属性】
技术研发人员：张霆，刘鸿君，吴建新，霍军生，张敏，邵立军，杜克贺，王国才，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，北京汇智泰康医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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