检测PML基因突变的方法、引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测PML基因突变的引物和方法，其包括(i)扩增PML基因所有外显子序列的引物；(ii)采用Sanger测序技术和测序引物。本发明专利技术可快速地将体内PML基因所有外显子中的突变检测出来。

Methods, primers and kits for detecting PML gene mutation

The invention discloses a primer and a method for detecting the mutation of PML gene, which includes (I) primers that amplify all exon sequences of PML gene, and (II) uses Sanger sequencing technology and sequence primers. The invention can quickly detect the mutations in all the exons of the PML gene in the body.

【技术实现步骤摘要】
检测PML基因突变的方法、引物和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测与急性早幼粒白血病(APL)发生有关的PML基因突变的引物、方法和试剂盒。
技术介绍
急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是一种起病凶险的恶性血液病，单纯依赖化疗，患者复发率高，总体生存较差。APL在中国人群中的发病率较其他人群高，可高达AML的17％～25.3％。APL的分子遗传学标志是PML-RARA融合基因的形成，产生的PML-RARA融合蛋白不仅是APL的分子标志，而且在APL发病中起关键作用。PML-RARA融合蛋白可以与维甲酸受体(RXR)结合，中断正常的维甲酸信号通路，抑制基因转录，阻滞粒细胞分化，最终导致APL的发生。近来研究表明PML-RARA的降解在APL白血病干细胞(leukemia-initiatingcell,LIC)的清除中起着重要的作用。PML基因位于15号染色体，包含10个外显子，属于TRIM家族。PML选择性剪接产生了不同分子量的亚型：PMLI是最长的亚型，由882个氨基酸组成，最短的亚型是PMLVIIb，仅有435个氨基酸构成。RBCC/TRIM结构域存在于所有的PML亚型中，由外显子1～3编码。RBCC结构域有一个末端环指结构域(R)、两个B-box结构域(B1和B2)和一个α螺旋卷曲螺旋结构域组成。PML蛋白具有多种生物学活性，包括抗病毒活性、肿瘤抑制作用、参与祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等等。有研究表明PML的降解对于慢性粒细胞白血病(CML)静止期LIC的清除有重要作用。PML的类泛素化促进前髓细胞白血病核小体(PML-NBs)形成，从而促进PML依赖的肿瘤抑制效应。三氧化二砷(As203)治疗可以使APL患者达到完全缓解，能够选择性地作用于PML-RARA和PML，导致蛋白降解。As203能够促进PML的核基质转移、SUMO化修饰和降解，在6h左右能够促进PML-NBs的增大；对于APL细胞，As203在12h左右能够促使PML-NBs重新形成，24h左右能够促使PML-RARA的降解。有研究显示As203对PML-RARA有类似的生物学效应，而对RARA则没有作用，这也说明PML-RARA融合蛋白中的PML部分是As203的直接作用靶点。2014年最新版美国权威指南NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork)和我国急性早幼粒细胞白血病诊治指南均新增维甲酸+砷剂作为APL患者的一线选择推荐。黄晓军课题组在一项研究中首次发现4个新的PML突变位点——A216T/S214L/L217F/S220G，并提出砷剂耐药时PML突变存在一个“突变热点区(C202-S220)”，该热点突变区位于PML基因的外显子3，即RBCC结构域中的B2结构域。文献报道指出，A216V、S214L、A216T对砷剂治疗具有强耐受，L217F、S220G对砷剂治疗表现弱耐受。这些发现完善了人们对APL患者砷剂耐药机制的认识。因此，对PML基因多态性的检测，将有助于APL患者在砷剂治疗过程中进行耐药监测，从而及时调整治疗方案，提高治愈率，减少复发，在临床上具有重要的意义，有望实现APL的分层治疗和个性化治疗，并为下一步克服耐药的研究提供靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测PML基因突变的引物，所述引物包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R，其碱基序列为：PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAGPML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCCPML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTCPML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGAPML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGCPML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAAPML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTCPML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAGPML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGGPML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAGPML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGAPML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGGPML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTTPML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCTPML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACCPML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGCPML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTAPML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。进一步地，还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术的目的还在于提供一种检测PML基因突变的方法，包括以下步骤：(1)提取样本中的DNA；(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；(4)将(3)中的碱基序列与PML基因外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exo本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测PML基因突变的引物，其特征在于，包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自PML‑Exon1‑F/PML‑Exon1‑R、PML‑Exon2‑F/PML‑Exon2‑R、PML‑Exon3‑F/PML‑Exon3‑R、PML‑Exon4‑F/PML‑Exon4‑R、PML‑Exon5/6‑F/PML‑Exon5/6‑R、PML‑Exon7‑F/PML‑Exon7‑R、PML‑Exon8‑F/PML‑Exon8‑R、PML‑Exon9‑F/PML‑Exon9‑R、PML‑Exon10‑F/PML‑Exon10‑R，其碱基序列为：PML‑Exon1‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAGPML‑Exon1‑R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCCPML‑Exon2‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTCPML‑Exon2‑R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGAPML‑Exon3‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGCPML‑Exon3‑R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAAPML‑Exon4‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTCPML‑Exon4‑R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAGPML‑Exon5/6‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGGPML‑Exon5/6‑R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAGPML‑Exon7‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGAPML‑Exon7‑R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGGPML‑Exon8‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTTPML‑Exon8‑R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCTPML‑Exon9‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACCPML‑Exon9‑R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGCPML‑Exon10‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTAPML‑Exon10‑R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。...

【技术特征摘要】
1.检测PML基因突变的引物，其特征在于，包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R，其碱基序列为：PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAGPML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCCPML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTCPML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGAPML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGCPML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAAPML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTCPML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAGPML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGGPML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAGPML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGAPML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGGPML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTTPML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCTPML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACCPML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGCPML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTAPML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。3.一种检测PML基因突变的方法，包括以下步骤：(1)提取样本中的DNA；(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；(4)将(3)中的碱基序列与PML基因外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R；所述一对测序引物选自M13F和M13R，其碱基序列为：PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAGPML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCCPML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTCPML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGAPML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGCPML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAAPML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTCPML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘赵玲，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：南昌艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36