一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了甲基化基因组合物及制备诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移试剂盒的用途。本发明专利技术发现，血清甲基化PITX1和甲基化AMOT可联合用于诊断预示LuminalA型乳腺癌骨转移，血清甲基化PTPN1和甲基化SLIT2可联合用于诊断预示LuminalB型乳腺癌骨转移，血清甲基化MYLK2、甲基化EFEMP1和甲基化SOSTDC1可联合用于诊断预示Her‑2过表达型乳腺癌骨转移，血清甲基化MYLK3和甲基化SCARA5可联合用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移，准确度达90％以上，检测成本低、非介入性、方便快捷。

Use of methylation gene composition and preparation diagnosis to predict the use of three negative breast cancer bone metastasis Kit

The invention discloses the methylation gene composition and the use of preparation diagnosis for predicting three negative breast cancer bone metastasis kit. The present invention found that serum PITX1 methylation and AMOT methylation can be jointly used for the diagnosis of bone metastasis of breast cancer that LuminalA, serum PTPN1 methylation and methylation of SLIT2 can be jointly used for the diagnosis of bone metastasis of breast cancer that LuminalB, serum MYLK2 methylation, EFEMP1 methylation and methylation of SOSTDC1 can be jointly used for diagnosis of Her indicates 2 overexpression breast cancer bone metastasis, serum MYLK3 methylation and methylation of SCARA5 can be jointly used for diagnosis of type three negative breast cancer predicted bone metastasis, the accuracy is more than 90%, low detection cost, non-invasive, convenient and quick.

【技术实现步骤摘要】
甲基化基因组合物及制备诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移试剂盒的用途
本专利技术属于生物化学领域，涉及诊断组合物及诊断试剂盒，具体涉及一种甲基化基因诊断组合物及在制备诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
技术介绍
乳腺癌是威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一，每年约有40-45万人死于乳腺癌(参考文献：不同分子亚型乳腺癌骨转移患者的临床特征和预后分析，西安交通大学学报·医学版，2017年9月第38卷第5期)。乳腺癌非常容易发生远处转移，骨是乳腺癌最常见的远处转移部位，大于50％的患者首发转移部位是骨组织(参考文献：Genesassociatedwithbreastcancermetastatictobone,JClinOncol,2006；ImplicationsofBone-OnlyMetastasesinBreastCancer:FavorablePreferencewithExcellentOutcomesofHormoneReceptorPositiveBreastCancer,CancerResTreat,2011)。根据雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)、人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2)的表达情况，可将乳腺癌分为4个亚型，分别为：LuminalA型、LuminalB型、Her-2过表达型和三阴性乳腺癌(参考文献：Geneexpressionpatternsofbreastcarcinomasdistinguishtumorsubclasseswithclinicalimplications,PNAS,2001)。研究表明，乳腺癌骨转移的预后与其分子分型、临床分期、淋巴结状态等密切相关(参考文献：PrevalenceandriskfactorsofbonemetastasisandskeletalrelatedeventsinpatientswithprimarybreastcancerinJapan,IntJClinOnco,2014)。不同分子亚型乳腺癌特定的分子生物学和临床病理特征，决定了其治疗方式及预后的差异。不同分子亚型乳腺癌骨转移的基因表型也存在差异。早期诊断乳腺癌骨转移是挽救患者生命的关键。目前，放射性核素骨扫描(ECT)、电子计算机断层扫描(CT)、核磁共振(MRI)、正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)和骨组织活检是发现和确诊乳腺癌骨转移的金标准。但是，这些方法均存在不同的不足，比如检查费用高，介入诊断增加了患者的负担。这增加了乳腺癌患者骨转移常规检测的压力。DNA甲基化是指基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上共价结合一个甲基基团，其主要参与基因的表达调控。许多基因的甲基化被证明与各种临床疾病密切相关，有些甚至可以被确定为疾病致病的独立因素。DNA甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关。因此，甲基化基因不仅可作为肿瘤分子诊断的标志物，同时也可作为分子治疗的靶标(参考文献：DNA甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值，分子诊断与治疗杂志2009年9月第1卷第3期)。研究表明，乳腺癌原发肿瘤的多种基因表达是发生骨转移所必需的，因而认为特定器官的转移是多因子共同作用的结果，该结论提示，骨的特异性转移是骨对原发肿瘤内不同表型肿瘤细胞的选择和骨源性因子诱导的结果，不同分子亚型乳腺癌骨转移的甲基化基因有望成为成为乳腺癌骨转移的诊断标志物(参考文献：KangY,SiegelPM,ShuW,etal.Amultigenicprogrammediatingbreastcancermetastasistobone.CancerCell,2003)。申请人旨在研究比较发生骨转移与未发生骨转移的乳腺癌患者血清中甲基化基因的差异，发现、验证可以用作诊断、预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的甲基化基因标志物，以提供一种通过血液即可快速诊断、预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的试剂盒和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种甲基化基因诊断组合物，制备成一种检测成本低、非介入性、方便快捷诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一、LuminalA型乳腺癌骨转移一种甲基化基因诊断组合物，由甲基化PITX1和甲基化AMOT组成。上述诊断组合物在制备诊断预示LuminalA型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。一种用于诊断预示LuminalA型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括甲基化PITX1和甲基化AMOT的PCR扩增引物。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化PITX1的PCR扩增上游引物如SequenceNO.1所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.2所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化AMOT的PCR扩增上游引物如SequenceNO.4所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.5所示。优选地，所述的诊断试剂盒中还包括甲基化PITX1和甲基化AMOT的焦磷酸测序引物。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化PITX1的焦磷酸测序引物如SequenceNO.3所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化AMOT的焦磷酸测序引物如SequenceNO.6所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括PCR扩增和焦磷酸测序所需的酶和试剂。一种诊断预示LuminalA型乳腺癌骨转移的方法，包括如下步骤：步骤S1，采集LuminalA型乳腺癌患者空腹静脉血，自然凝固后离心分离出血清；步骤S2，提取血清总DNA，经PCR扩增、DNA亚硫酸盐修饰和焦磷酸测序测定总DNA中甲基化PITX1和甲基化AMOT的甲基化指数，依次用X1、X2表示；步骤S3，将X1、X2值代入二元逻辑回归方程Y＝1/[1+EXP(1.499X1+2.302X2-0.258)]得到Y值，Y值小于0.238预示该乳腺癌患者发生骨转移，大于0.238预示未发生骨转移。二、LuminalB型乳腺癌骨转移一种甲基化基因诊断组合物，由甲基化PTPN1和甲基化SLIT2组成。上述诊断组合物在制备诊断预示LuminalB型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。一种用于诊断预示LuminalB型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括甲基化PTPN1和甲基化SLIT2的PCR扩增引物。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化PTPN1的PCR扩增上游引物如SequenceNO.7所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.8所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化SLIT2的PCR扩增上游引物如SequenceNO.10所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.11所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括甲基化PTPN1和甲基化SLIT2的焦磷酸测序引物。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化PTPN1的焦磷酸测序引物如SequenceNO.9所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，甲基化SLIT2的焦磷酸测序引物如SequenceNO.12所示。优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括PCR扩增和焦磷酸测序所需的酶和试剂。一种诊断预示LuminalB型乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基化基因诊断组合物，其特征在于由甲基化MYLK3和甲基化SCARA5组成。

【技术特征摘要】
1.一种甲基化基因诊断组合物，其特征在于由甲基化MYLK3和甲基化SCARA5组成。2.权利要求1所述的诊断组合物在制备诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。3.一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，其特征在于：包括甲基化MYLK3和甲基化SCARA5的PCR扩增引物。4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于：甲基化MYLK3的PCR扩增上游引物如SequenceNO.22所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.23所示。5.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于：甲基化SCARA5的PCR扩增上游引物如SequenceNO.25所示，PCR扩增下游引物如SequenceNO.26所示。6.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于：还包括甲基化MYLK3和甲基化SCARA5的焦磷酸测序引物。7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛守海，李宜健，童强，刘敏涛，胡雨祝，
申请(专利权)人：薛守海，
类型：发明
国别省市：江苏,32