用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，以及将膀胱癌患者进行分层以进行肿瘤治疗的方法。本发明专利技术还涉及相应有试剂盒及其用途，以及用于膀胱癌的预后生物标志物，特别是单一的预后生物标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于膀胱癌分子亚型分型的方法和试剂盒
本专利技术涉及一种用于鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，以及将膀胱癌患者进行分层以进行肿瘤治疗的方法。本专利技术还涉及相应有试剂盒及其用途，以及用于膀胱癌的预后生物标志物，特别是单一的预后生物标志物。
技术介绍
基于组织病理学评估，膀胱癌被认为异质性非常高，其包括全部的不同组织病理学亚型(乳头状，非乳头状，鳞状细胞癌，腺癌，肉瘤，小细胞癌等)。还已知膀胱癌具有广泛多变的临床结果，而且对局部或全身治疗具有显着差异。对膀胱癌的预后和治疗非常重要的是侵入深度。未侵入肌肉层的肿瘤称为表层或非肌层浸润性肿瘤(非肌层肉浸润性膀胱癌，NMIBC)。NMIBC占所有膀胱肿瘤的70％左右。NMIBC不会立即危及生命，但是具有高度的复发倾向，需要进行终生的且昂贵的监护。目前，尽管事实表明在非手术治疗的情况下仍有额外的治疗选择，但是按照当前的治疗标准(经尿道切除术联合卡介苗(BCG)滴注)来看，仍然有超过30％的表层膀胱癌患者明显治疗不足，从而发展为转移性并死亡。表层膀胱肿瘤可以在经尿道切除术中被切除器刮掉，其也可用于肿瘤的病理分期。膀胱内施用BCG是一种免疫治疗方法，可以用来预防表层膀胱癌的复发。然而，高达60％的NMIBC复发，需要进一步更极端性的手术(即膀胱切除术)、局部治疗(例如辐射)和/或化疗(其可以直接滴入膀胱)。更具体地说，已经观察到“30定律”，意味着在局部切除术和BCG辅助滴注治疗后，30％的患者未复发，30％的患者复发并需要更极端性的治疗，30％的患者快速进展成为转移性。因此，虽然在许多情况下，局部切除术和BCG治疗是足够的，膀胱可以保留相当长的时间，但是，其他患者却会受到这些当前治疗方案的伤害，并且需要直接的极端性膀胱切除术和围手术期化疗来达到治疗目的。显然，临床上需要更好地评估非肌层浸润性膀胱癌患者的个体风险，以便更好地利用基本治愈方案中现有的治疗方案，例如通过分层患者获得更个体化治疗方法。进一步侵入肌层的肿瘤称为肌层浸润性膀胱癌(MIBCs)。MIBCs需要极端性膀胱切除和围手术期基于顺铂的联合化疗。目前，治疗的选择完全基于临床病理特征，这些特征严重不准确，导致临床分期不足的比率高得令人无法接受，并导致采用治疗不足并因此危及生命的治疗方案。此外，常规化疗只对30％的病例有效。重要的是，基于顺铂的新辅助化疗提供了获得肌层浸润性膀胱癌患者的病理完全反应的机会，接着与优良的长期保留且较不极端性的手术干预进行联合治疗。然而，对于对新辅助化疗无反应的肿瘤，立即进行极端性手术干预似乎是预防进一步进展和死亡的更好的治疗选择。因此，临床上有很大的需要去识别可能对化疗有反应的肿瘤，并决定最佳的治疗方案(新辅助化疗或辅助化疗)。此外，靶向治疗方案如抗激素(内分泌)或抗HER2疗法目前尚未得到应用，也不可能通过常规方法建立对这些受体的检测，以便能够预测对相应的靶向治疗的反应的方法。总之，医学上需要更好地为膀胱癌患者的复发风险和对化疗或替代治疗的反应进行分类，这对于非浸润性和浸润性膀胱肿瘤患者是非常重要的。重要的是，对于两种膀胱癌不同分期的患者，由于目前的临床病理特征不能可靠地评估预后，所以目前尚不清楚最佳的治疗方案。目前世界上使用的检测癌症(例如乳腺癌)受体状态的标准方法为由福尔马林固定且石蜡包埋(FFPE)活组织切片或切除组织的免疫组织化学(IHC)。在乳腺癌中，内分泌或靶向全身治疗(例如曲妥珠单抗)的施用主要基于IHC。然而，通过基于IHC的方法测试多个标记来确定个体风险，并不能导致可靠的膀胱癌预后分类，这可能有助于解决所描述的诊断和治疗困境。此外，IHC的测试通常缺乏灵敏性。因此，显然需要一种可靠、客观、定量和可重复的膀胱癌分子亚型检测系统，如患者分层，以进行可靠的个体风险评估，从而有利于选择合适的肿瘤治疗方案，并可预测治疗的预后及预测治疗的成功。此外，这种测试系统应允许适合大部分癌症患者的分散测试。这些以及其他目的通过下面将要描述的本专利技术来解决。专利技术概述在一个方面，本专利技术涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本中至少一种选自人表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ESR1)、孕激素受体(PGR)、增殖抗原Ki-67(Ki67)和RacGTP酶激活蛋白1(RACGAP1)基因的RNA转录本的表达水平。在一个实施方案中，确定选自HER2、ESR1、PGR、Ki67和RACGAP1中的至少两种、三种或四种基因的RNA转录本的表达水平。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；和(b)确定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平，其中，所述方法还包括确定肿瘤样本中至少一种选自Ki67和RACGAP1基因的RNA转录本的表达水平。在一个实施方案中，本专利技术涉及鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；(b)确定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平；(c)确定肿瘤样本中PGR的RNA转录本的表达水平；和，优选地，(d)确定肿瘤样本中至少一种选自K167和RACGAP1基因的RNA转录本的表达水平。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；(b)测定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平；(c)确定肿瘤样本中PGR的RNA转录本的表达水平；和(d)确定肿瘤样本中Ki67的RNA转录本的表达水平。在一个实施方案中，所述确定RNA转录本的表达水平包括确定RNA转录本的表达水平是低于还是高于RNA转录本的设定表达阈值。在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)、(c)和(d)之前进行。在一个实施方案中，步骤(d)在步骤(a)、(b)和(c)之后进行。在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行，步骤(b)在步骤(c)之前进行，步骤(c)在步骤(d)之前进行。在一个实施方案中，所述分子亚型选自HER2阳性、三阴性，管腔A(luminalA)型和管腔B(luminalB)型。在一个实施方案中，所述HER2的RNA转录本的表达水平比HER2的RNA转录本的设定表达阈值高，将肿瘤的分子亚型鉴定为HER2-阳性。在一个实施方案中，所述ESR1的RNA转录本的表达水平高于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值，表示阳性预后，其中，优选地，所述阳性预后包括无复发存活(RFS)、无进展存活(PFS)、疾病特异性存活(DSS)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选RFS和/或PFS的概率升高。在一个实施方案中，所述ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值，表示阴性预后，其中，优选地，所述阴性预后包括无复发存活(RFS)、无进展存活(PFS)、疾病特异性存活(DSS)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选RFS和/或PFS的概率降低。在一个实施方案中，HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；PGR的RNA转录本的表达水平低于P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本中至少一种选自人表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ESR1)、孕激素受体(PGR)、增殖抗原Ki‑67(Ki67)和RacGTP酶激活蛋白1(RACGAP1)基因的RNA转录本的表达水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.17 EP PCT/EP2015/0532831.一种鉴定膀胱癌患者肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本中至少一种选自人表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ESR1)、孕激素受体(PGR)、增殖抗原Ki-67(Ki67)和RacGTP酶激活蛋白1(RACGAP1)基因的RNA转录本的表达水平。2.如权利要求1所述的方法，确定选自HER2、ESR1、PGR、Ki67和RACGAP1中的至少两种、三种或四种基因的RNA转录本的表达水平。3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；和(b)确定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平，其中，所述方法还包括确定肿瘤样本中至少一种选自Ki67和RACGAP1基因的RNA转录本的表达水平。4.如权利要求1-3任一所述的方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；(b)确定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平；(c)确定肿瘤样本中PGR的RNA转录本的表达水平；和，优选地，(d)确定肿瘤样本中至少一种选自K167和RACGAP1基因的RNA转录本的表达水平。5.如权利要求4所述的方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定肿瘤样本中HER2的RNA转录本的表达水平；(b)测定肿瘤样本中ESR1的RNA转录本的表达水平；(c)确定肿瘤样本中PGR的RNA转录本的表达水平；和(d)确定肿瘤样本中Ki67的RNA转录本的表达水平。6.如权利要求1-5任一所述的方法，所述确定RNA转录本的表达水平包括确定RNA转录本的表达水平是低于还是高于RNA转录本的设定表达阈值。7.如权利要求4-6任一所述的方法，步骤(a)在步骤(b)、(c)和(d)之前进行。8.如权利要求4-7任一所述的方法，步骤(d)在步骤(a)、(b)和(c)之后进行。9.如权利要求4-8任一所述的方法，步骤(a)在步骤(b)之前进行，步骤(b)在步骤(c)之前进行，步骤(c)在步骤(d)之前进行。10.如权利要求1-9任一所述的方法，所述分子亚型选自HER2阳性、三阴性，管腔A(luminalA)型和管腔B(luminalB)型。11.如权利要求3-10任一所述的方法，所述HER2的RNA转录本的表达水平比HER2的RNA转录本的设定表达阈值高，将肿瘤的分子亚型鉴定为HER2-阳性。12.如权利要求11所述的方法，所述ESR1的RNA转录本的表达水平高于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值，表示阳性预后，其中，优选地，所述阳性预后包括无复发存活(RFS)、无进展存活(PFS)、疾病特异性存活(DSS)和远端无复发存活中的一种或多种的概率升高，优选RFS和/或PFS的概率升高。13.如权利要求11或12所述的方法，在一个实施方案中，所述ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值，表示阴性预后，其中，优选地，所述阴性预后包括无复发存活(RFS)、无进展存活(PFS)、疾病特异性存活(DSS)和远端无复发存活中的一种或多种的概率降低，优选RFS和/或PFS的概率降低。14.如权利要求4-10任一所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平低于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平低于或高于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为三阴性。15.如权利要求4-10任一所述的方法，所述分子亚型为管腔A(luminalA)型或管腔B(luminalB)型。16.如权利要求15所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平高于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平高于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平高于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminalB)型17.如权利要求15所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平高于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平高于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平低于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔A(luminalA)型。18.如权利要求15所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平高于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平低于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平低于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminalB)型。19.如权利要求所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平高于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平高于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminalB)型。20.如权利要求15所述的方法，其中-HER2的RNA转录本的表达水平低于HER2的RNA转录本的设定表达阈值；-ESR1的RNA转录本的表达水平低于ESR1的RNA转录本的设定表达阈值；-PGR的RNA转录本的表达水平高于PGR的RNA转录本的设定表达阈值；和-Ki67的RNA转录本的表达水平低于Ki67的RNA转录本的设定表达阈值将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔A(luminalA)型。21.如权利要求10-20任一所述的方法，其中-所述管腔A型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(DSS)的概率相关，该概率比与管腔B型分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少10％，优选至少15％；-所述管腔A型分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与HER2阳性分子亚型或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少30％，优选至少35％；和/或-所述管腔B型分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与HER2阳性分子亚型或三阴性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少10％，优选至少15％。22.如权利要求10-20任一所述的方法，所述患者是男性患者，其中-所述管腔A型分子亚型与治疗后10年的疾病特异性存活(DSS)的概率相关，该概率比与管腔B型分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少10％，优选至少15％；-所述管腔A型分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与HER2阳性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少15％，优选至少20％；-所述管腔A型分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少30％，优选至少35％；-所述管腔B型分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少15％，优选至少20％；和/或-所述HER2阳性分子亚型与治疗后10年的DSS的概率相关，该概率比与三阴性分子亚型相关的治疗后10年的DSS的概率高至少10％，优选至少15％。23.如权利要求1-22任一所述的方法，所述膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)或肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。24.如权利要求1-23任一所述的方法，所述样本是从肿瘤提取的RNA。25.如权利要求1-24任一所述的方法，通过逆转录(RT)定量PCR(RT-qPCR)确定RNA转录本的表达水平。26.如权利要求25所述的方法，所述定量PCR是实时荧光定量PCR。27.如权利要求25或26所述的方法，所述方法包括使用具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQIDNO：1和2所示序列的至少10个连续核苷酸的ESR1特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQIDNO：4和5所示序列的至少10个连续核苷酸的HER2特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQIDNO：7和8所示序列的至少10个连续核苷酸的Ki67特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQIDNO：10和11所示序列的至少10个连续核苷酸的PGR特异性引物，和/或具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQIDNO：13和14所示序列的至少10个连续核苷酸的RACGAP1特异性引物。28.如权利要求25-27任一所述的方法，所述方法包括使用具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫·马库斯·维尔茨，
申请(专利权)人：百欧恩泰诊断有限责任公司，斯卓蒂费尔分子病理学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE