检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种用于检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的试剂盒，其包括扩增VSV

【技术实现步骤摘要】
检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种临床检验用途的检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，针对VSV
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G包膜基因片段特异性扩增，非常适合在Car
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T细胞临床试验的早期来检测RCL/RCR，更好地控制RCR/RCL风险。

技术介绍

[0002]随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(CAR
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T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR
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T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scfv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scfv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。同时，经过CAR改造后的T细胞能够以HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非mhc限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
[0003]Car
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T细胞疗法在血液肿瘤中的治疗效果得到了越来越多的认可，因此成为肿瘤免疫治疗领域中的热点。在Car
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T细胞的生产中，主要是依靠逆转录病毒载体或慢病毒载体将Car基因导入到T细胞中，在此过程中也可能使得Car
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T产品受到复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的污染。有RCR/RCL污染的产品如果被回输到患者体内可能有造成二次肿瘤的风险，所以在Car
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T细胞产品的生产各个环节中都会涉及到RCR/RCL的检测，以确保无RCR/RCL污染，目前建立的RCL检测方法并不多，虽然RCR/RCL细胞感染试验有较高的灵敏度，但是该方法耗时长，本专利技术所建立的检测方法以针对VSV
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G包膜基因片段的荧光定量PCR为基础，在确保高灵敏度的同时，可以快速检测，且假阳性低。可以有效地作为Car
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T细胞生产环节中的质控手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术设计了针对VSV
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G包膜基因片段的引物和探针序列，用于检测CarT细胞中的复制型慢病毒污染，采用荧光定量PCR技术，利用标准曲线的方法，构建了VSV
‑
G的定量标准曲线，可以实现对VSV
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G片段的定量检测，从而间接定量RCL。
[0005]一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针针对VSV
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G包膜基因进行定量检测，所述引物和探针的碱基序列如下：
[0006]VG
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F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
[0007]VG
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R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
[0008]VG
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probe:FAM
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TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA
–
MGB。
[0009]本专利技术还提供了一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA提取试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括扩增VSV
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G包膜基因片段的引物和探针，所述引物和探针的碱基序列如下：
[0010]VG
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F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
[0011]VG
‑
R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
[0012]VG
‑
probe:FAM
‑
TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA
–
MGB。
[0013]本专利技术试剂盒使扩增效率和速率均达到最佳，最低检测限可以下探到10拷贝。
[0014]进一步地，所述阳性对照品为含有VSV
‑
G片段的质粒DNA稀释液；所述阴性对照品为未经过转染的人正常细胞提取DNA。
[0015]本专利技术的有益效果：本专利技术将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用标准曲线的方法，构建了VSV
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G的定量标准曲线，检测Car
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T细胞产品中是否存在RCL污染，可用于Car
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T细胞产品生产各个环节的质量控制。经过优化后的引物、探针和合理的体系、检测条件可以使整个试剂盒对VSV
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G片段的检测下限下探到10拷贝数(检出率100％)。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，所建立的检测方法以针对VSV
‑
G包膜基因片段的荧光定量PCR为基础，在确保高灵敏度的同时，可以快速检测，且假阳性低，可以有效地作为Car
‑
T细胞生产环节中的质控手段。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0017]实施例1
[0018]定量检测检测CarT细胞中复制型慢病毒(RCL)的检验试剂盒包括：
[0019]血液/组织DNA抽提试剂(天根生物)；
[0020]检测体系PCR反应液：THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2
×
)、VG上、下游引物各0.8uM、VG探针0.4uM；
[0021]其中：
[0022]VG
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F:AGGGAACTGTGGGATGACTG
[0023]VG
‑
R:GAACACCTGAGCCTTTGAGC
[0024]VG
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probe:FAM
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TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA
–
MGB。
[0025]阳性对照品为CarT细胞产品中提取的DNA；所述阴性对照品为未经过转染的人正常细胞提取DNA。
[0026]实施例2
[0027]本方法的操作流程：
[0028]血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
[0029](1)抽提血液中的组织DNA：
[0030]1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
[0031]2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
[0032]3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针针对VSV
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G包膜基因进行定量检测，所述引物和探针的碱基序列如下：VG
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F:AGGGAACTGTGGGATGACTGVG
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R:GAACACCTGAGCCTTTGAGCVG
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probe:FAM
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TATGAAGACGTGGAAATTGGACCCA
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MGB。2.一种检测CarT细胞中是否存在RCL污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA提取试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴...

【专利技术属性】
技术研发人员：林筱剑，
申请(专利权)人：南昌艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：