利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒，包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括检测目的基因用上下游引物PDGFRα‑F、PDGFRα‑R以及探针PDGFRα‑Probe，检测内参基因β‑actin引物β‑actin‑F，β‑actin‑R及探针β‑actin‑Probe。本发明专利技术将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β‑actin和目的基因PDGFRα的定量标准曲线，可检测受测者体内PDGFRα的相对于内参基因的表达水平。

Real-time fluorescent quantitative PCR kit for detection of relative expression of PDGFRalpha gene

The invention discloses a reagent kit for detecting the relative expression of PDGFRalpha gene by real-time fluorescent quantitative PCR, which includes RNA extraction reagent, reverse transcription reagent, detection system PCR reaction solution, positive and negative control substance, and detection system PCR reaction solution includes upstream and downstream primers PDGFRalpha F, PDGFRalpha R and probe PDGFRalpha Probe for detecting internal reference gene beta. _actin primers beta actin_F, beta actin_R and probe beta actin_Probe. In the invention, real-time fluorescent PCR technology is combined with Taqman probe, and the quantitative standard curves of internal reference gene beta actin and target gene PDGFRalpha are constructed by using the method of double standard curves. The relative expression level of internal reference gene PDGFRalpha in the subjects can be detected.

【技术实现步骤摘要】
利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒
本专利涉及一种临床检验用途的基因相对表达量的检测试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，用于检测肿瘤患者体内PDGFRα基因表达水平，通过表达水平的高低评判药物的疗效和预后。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。
技术介绍
多靶点抑制理论(多靶点抑制EGFR、VEGFR、FGFR、PDGFR等)的提出和新药的研制，对于与肿瘤靶向治疗相关的生长因子受体研究进展显著，其中血小板衍生生长因子PDGFR(Platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)更是成为了继EGFR、VEGF/VEGFR后新的研究热点。PDGFR是分子量为180KD的单链跨膜蛋白，胞外部分为配体结合结构域，胞内部分为蛋白激酶催化区域。PDGFR共有两种亚基(α、β)，在未结合配体PDGF的情况下以单体存在；一旦结合PDGF则会触发受体亚基之间形成二聚体复合物(αα、αβ、ββ)，使受体磷酸化从而激活下游信号分子产生一系列生物效应。PDGFR作为受体酪氨酸蛋白激酶家族中的一员，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖，在机体生长发育、创伤修复等正常生理过程中起着积极的作用。成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及神经细胞等多种细胞均有PDGFR分布。但在肿瘤组织当中，PDGFR会因PDGF结合，介导酪氨酸磷酸化信号传导，直接或间接地促进肿瘤增殖和迁移。此外，研究还表明PDGFR介导酪氨酸磷酸化通路，可上调肿瘤组织间隙液压，影响小分子化合物的运输，从而降低抗肿瘤药物的摄取和疗效。而大量的实验以及临床数据亦表明PDGFR的表达水平高低深刻地影响着肿瘤的产生、恶化和患者的治疗、预后，如PDGFR的高表达与胃癌的浸润、淋巴结和远处转移及临床分期密切相关，与肿瘤大小、组织分型无关。PDGFR活化后能提高细胞外基质的降解代谢，有利于血管的形成，说明PDGFR在胃癌微血管形成中起促进作用，其高表达与胃癌的转移行为有密切关系；乳腺癌的研究中发现PDGFR-β能促进乳腺癌组织的血管形成并在早期乳腺癌中呈高度表达状态，与乳腺癌的恶化和进展密切相关，并且参与了肿瘤的侵袭和转移；大肠癌研究表明PDGFR-α的表达与患者的年龄、肿瘤的大小、分化类型无关，而与Duke目分期和淋巴结转移关系密切。此外，在肝癌、肺神经内分泌癌、卵巢上皮性癌等研究中亦证明PDGFR的活化与肿瘤血管生成，肿瘤的发生、发展、浸润、转移具有密切的关系。随着相关研究的深入和开展PDGF/PDGFR拮抗剂与其它靶标的靶向治疗极有发展前景。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是对具有抑制酪氨酸激酶活性的药物总称，靶向PDGFRα的酪氨酸激酶抑制剂有伊马替尼(格列卫)，舒尼替尼和索拉菲尼，是临床最常用的抗肿瘤药物之一。此类药物具有双重抗肿瘤效应，一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面通过抑制PDGFRα而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明，PDGFRαmRNA表达水平检测对患者接受靶向治疗有明显的指导意义。PDGFRα基因突变引起表达降低，实验证实在体外对伊马替尼(格列卫)敏感；PDGFRα表达水平除了和药物疗效有关，还与癌症患者的预后相关，临床实验数据表明，PDGFRα低表达患者较高表达者有更好的3年无进展生存期和3年总生存率。目前临床上已经将PDGFRα基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对PDGFRα基因mRNA含量进行检测。RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足PDGFRα基因mRNA含量的检测，进而选择有效的治疗方式和合适的针对性药物，有利于研究用药前和用药后PDGFRα表达水平对抗肿瘤药物效用的影响，便于抗肿瘤药物的开发。被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。
技术实现思路
本专利技术设计了检测内参/目的基因的引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因PDGFRα两种类型的定量标准曲线，检测PDGFRα相对于内参基因的表达水平。试剂盒通过调整两个基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：(1)检测目的基因用上下游引物PDGFRα-F、PDGFRα-R以及探针PDGFRα-Probe，其序列如下：PDGFRα-F：CGATTGTGGTCACCTGTGCPDGFRα-R：TGGATGGGACTTTGATTTCTTPDGFRα-Probe：FAM-ACCTTCAATGGACTTACCCTGGAGA–TAMRA；(2)检测内参基因β-actin的上下游引物β-actin-F、β-actin-R以及探针β-actin-Probe，其序列如下：β-actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTTβ-actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTTβ-actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。进一步地，所述RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇；所述逆转录试剂包括TOYOBO公司的ReverTraAceqPCRRTKit。检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物PDGFRα-F、PDGFRα-R以及探针PDGFRα-Probe，检测内参基因β-actin引物β-actin-F，β-actin-R及探针β-actin-Probe。进一步地，所述阳性对照品分别为含有对应PDGFRα基因的溶液；所述阴性对照品为无对应PDGFRα基因的溶液。本专利技术的有益效果：本专利技术将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因PDGFRα的定量标准曲线，检测受测者体内PDGFRα的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：(1)检测目的基因用上下游引物PDGFRα‑F、PDGFRα‑R以及探针PDGFRα‑Probe，其序列如下：PDGFRα‑F：CGATTGTGGTCACCTGTGCPDGFRα‑R：TGGATGGGACTTTGATTTCTTPDGFRα‑Probe：FAM‑ACCTTCAATGGACTTACCCTGGAGA–TAMRA；(2)检测内参基因β‑actin的上下游引物β‑actin‑F、β‑actin‑R以及探针β‑actin‑Probe，其序列如下：β‑actin‑F：TGAGCGAGGCTACAGCTTβ‑actin‑R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTTβ‑actin‑Probe：FAM‑ACCACCACGGCCGAGCGG‑TAMRA。

【技术特征摘要】
1.利用实时荧光定量PCR检测PDGFRα基因相对表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：(1)检测目的基因用上下游引物PDGFRα-F、PDGFRα-R以及探针PDGFRα-Probe，其序列如下：PDGFRα-F：CGATTGTGGTCACCTGTGCPDGFRα-R：TGGATGGGACTTTGATTTCTTPDGFRα-Probe：FAM-ACCTTCAATGGACTTACCCTGGAGA–TAMRA；(2)检测内参基因β-actin的上下游引物β-actin-F、β-actin-R以及探针β-actin-Probe，其序列如下：β-acti...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，吴鹏飞，
申请(专利权)人：南昌艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36