CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记制造技术

本发明专利技术属于猪遗传标记制备与应用技术领域，涉及CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记。该遗传标记从猪CATSPER4基因外显子3上克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。公开了猪CATSPER4基因外显子3上SNP位点及其SNP分型的检测方法，CATSPER4基因外显子3上存在一个等位基因的突变，该突变引起AlwNI‑RFLP多态性。本发明专利技术筛选步骤包括：从猪血液中提取基因组DNA，从测序结果里寻找SNP位点，确定该SNP位点的内切酶，通过设计引物，PCR扩增，单核苷酸多态性检测，对基因型与精液品质性状间进行相关性分析。本发明专利技术筛选的标记可在猪标记辅助选择中应用。

SNP of exon third of CATSPER4 gene is a genetic marker for pig semen quality traits

The invention belongs to the technical field of pig genetic mark preparation and application, and relates to the SNP of exon third of CATSPER4 gene as a genetic marker for pig semen quality traits. The genetic marker was cloned from exon 3 of pig CATSPER4 gene and its nucleotide sequence was shown as SEQ ID NO:3. The detection of SNP locus and its SNP typing on exon 3 of pig CATSPER4 gene was revealed. A mutation of allele was found on exon 3 of CATSPER4 gene, which caused AlwNI * RFLP polymorphism. The screening steps of the invention include extracting genomic DNA from pig blood, searching for SNP locus from the sequencing results, and determining the endonuclease of the SNP site. By designing primers, PCR amplification and single nucleotide polymorphisms detection, the correlation analysis between genotype and semen quality traits is conducted. The selected markers can be applied to pig marker assisted selection.

【技术实现步骤摘要】
CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记
本专利技术涉及猪遗传标记制备
，具体涉及一种CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记及应用，它包括猪CATSPER4基因突变位点的检测方法与应用。
技术介绍
公猪的繁殖性能对猪群规模和猪场效益具有重要作用，一般通过鉴定精液品质来衡量公猪的繁殖性能。精液品质的指标包括精子浓度、精子活力、畸形精子率和精子形态以及动力学参数和DNA完整性等。精液品质主要是由遗传作用和环境作用两个因素决定，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有不断改良遗传作用才是提高精液品质和公猪的繁殖性能的关键。公猪繁殖性状遗传力低，使得常规的选择方法很难在短期内获得较大进展。随着分子生物学和分子遗传学的快速发展，标记辅助选择成为了提高公猪精液质量的有效方法。CATSPER4基因是精子特异性阳离子通道家族4，在梅山公猪睾丸组织中的发育性表达分析表明了其在初生时启动，受到发育阶段的调控，具有阶段特异性。有研究表明CATSPER4极有可能参与受精过程，因为其mRNA在成熟的精子细胞中表达，且其蛋白在睾丸和附睾中是特异表达的(SongCetal.Molecularcloning,spatialandtemporalexpressionanalysisofCatSpergenesintheChineseMeishanpigs.ReprodBiolEndocrinol,2011,9:132)。CATSPER4蛋白主要定位于精子头部顶体(LiuJetal.CatSperbeta,anoveltransmembraneproteinintheCatSperchannelcomplex.JBiolChem,2007,282(26):18945-52)，参与精子超活化的调控(JinJLetal.Catsper3andcatsper4encodetwocationchannel-likeproteinsexclusivelyexpressedinthetestis.BiolReprod,2005,73(6):1235-42)。敲除CATSPER4，直接影响顶体反应的调控过程，精子将出现超活化运动的缺失以及雄性完全不育(QiHetal.AllfourCatSperionchannelproteinsarerequiredformalefertilityandspermcellhyperactivatedmotility.ProcNatlAcadSciUSA,2007,104(4):1219-23)。所以本专利技术推测CATSPER4基因在精子发生过程中发挥着重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得一种猪精液品质性状关联的遗传标记，根据测序结果，寻找CATSPER4基因的突变位点，检测基因的多态性，为猪的标记辅助选择提供一种新的标记资源和选择方法。本专利技术的技术方案如下所述：本专利技术获得了一种猪精液品质性状的遗传标记，它是基于60日龄大白猪和180日龄大白猪睾丸组织RNA测序的结果，在测序结果里发现CATSPER4基因上存在多态位点，其外显子3上的第294位碱基处存在一个等位基因G/T的突变，该突变导致PCR-AlwNI-RFLP多态性。申请人提供了一种筛选猪精液品质性状的遗传标记的方法，按照以下步骤：从猪血液中提取基因组DNA。登录Ensembl数据库中下载猪CATSPER4基因序列(登录号为ENSSSCG00000026526)作为靶序列，在序列中找出从测序结果中筛选出的SNP位点，即外显子3上的G/T等位基因(位于该序列的第294位碱基处)突变(如图1)，对该SNP位点设计特异引物(该特异引物的序列如序列表SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示)，以常用的杜洛克猪、大白猪和长白猪基因组DNA为模板扩增(如图2所示)，根据其所获得的目的片段发现该突变引起了AlwNI酶切位点(CAGNNN↓CTG)多态性，然后对该G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)进行检测，所得SNP位点的检测结果如图3所示。本专利技术提供了鉴定上述序列G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法，通过在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经AlwNI酶切分型及检测。并利用AlwNI-RFLP方法确定杜洛克猪、大白猪和长白猪的不同基因型个体与精液品质性状间的关联分析的应用。更详细的专利技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明图1：本专利技术筛选的与猪精液品质性状关联的SNP遗传标记的核苷酸序列。图2：实施猪CATSPER4基因基因型分型的引物扩增片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％。附图标记说明：M泳道为DNAMarkerDL2,000；泳道1-10为序列表SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为410bp。图3：猪CATSPER4基因片段AlwNI-RFLP检测结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2.0％。附图标记说明：泳道M为DNAMarkerDL2,000；泳道1为TT基因型，片段大小分别为410bp；泳道3、4、6、7、8、9、10为TG基因型，片段大小分别为410bp，291bp，119bp；泳道2、5为GG基因型，片段大小为291bp，119bp。根据本专利技术的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。具体实施方式对序列表序列的说明：序列表SEQIDNO：1：是扩增的国外血缘猪品种“杜洛克猪”、“大白猪”和“长白猪”的核苷酸序列。该序列就是本专利技术克隆得到的与猪精液品质性状关联的SNP遗传标记的序列，在该序列的294位碱基处存在一个等位基因G/T的突变，该突变导致的AlwNI-RFLP的多态性。序列表SEQIDNO：2：是实施猪CATSPER4基因外显子3上G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物序列。序列表SEQIDNO：3是实施猪CATSPER4基因外显子3上G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物序列。实施例1：猪CATSPER4基因片段的获得及多态性检测方法的建立登录Ensembl数据库中下载猪CATSPER4基因序列(登录号为ENSSSCG00000026526)，在序列中找出所筛选的SNP位点，利用PrimerPremier5软件设计引物。正向引物序列如序列表SEQIDNO：2所示，即，CATSPER4-AlwNI-F：GCAATGACCACAGCGAAGA，反向引物序列如序列表SEQIDNO：3所示，即，CATSPER4-AlwNI-R：TGCTCAGGCCCGTTAGATC。扩增得到一个410bp的目的片段(该片段的序列如SEQIDNO:1所示(见图2)。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为1μl，每条引物为0.5μl，PCRMix为12.5μl，最后再加10.5μl去离子水至总体积为25μl；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性40s、58本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与猪精液品质性状关联的遗传标记，其特征在于，所述的遗传标记的核苷酸序列如下所示：GCAATGACCACAGCGAAGACCTCCCAGCAGTGACCCACTTTAGTGGCCACTTGGGTAGTGACCGCTACGCTGATGCCCCCATTCCATGGTCCCCTCTCAGGCAACTTCTTCCCACAGGAGTGGCCCCCAAGAGTCCCTATTCACTGAGAGCAAACTTCCAGGCAGAGGCCTCCTACAGTGACACCTGCCTGAAGGAAGTCCCCCACCCTCTCCCAGGATACCTGGGACATGCAGGAGTTCATCACTCGCATGTATGTCAAGCAGCTGCTCCGACACCCGGCCTTCCAGCTGCTRCTGGCCACGCTGCTGGTGGTCAATGCCATCACCATCGCTCTCCGCACCAACTCCGCCCTTGGCCAGGTGGGACTTCAGCCTGATTTCCGTCCCCACTGATCTAACGGGCCTGAGCA，上述序列中的294位的碱基R是G或T，该突变导致AlwNI‑RFLP多态性。

【技术特征摘要】
1.一种与猪精液品质性状关联的遗传标记，其特征在于，所述的遗传标记的核苷酸序列如下所示：GCAATGACCACAGCGAAGACCTCCCAGCAGTGACCCACTTTAGTGGCCACTTGGGTAGTGACCGCTACGCTGATGCCCCCATTCCATGGTCCCCTCTCAGGCAACTTCTTCCCACAGGAGTGGCCCCCAAGAGTCCCTATTCACTGAGAGCAAACTTCCAGGCAGAGGCCTCCTACAGTGACACCTGCCTGAAGGAAGTCCCCCACCCTCTCCCAGGATACCTGGGACATGCAGGAGTTCATCACTCGCATGTATGTCAAGCAGCTGCTCCGACACCCGGCCTTCCAGCTGCTRCTGGCCACGCTGCTGGTGGTCAATGCCATCACCATCGCTCTCCGCACCAACTCCGCCCTTGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤娥，赵丽萍，宋慧彬，冯越，陈大可，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42