一种食品中鸭源成分快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供一种食品中鸭源成分快速检测方法及试剂盒，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明专利技术首先筛选出一个鸭源通用内标准基因LOC106018245，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在鸭物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定鸭源的靶基因。以该基因为靶序列设计了LAMP扩增引物，与LAMP反应液一起进行恒温扩增，LAMP反应产物用于胶体金核酸试纸条检测。LAMP反应结合胶体金核酸试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的鸭源成分，检测灵敏度可达0.2％(w/w)。本发明专利技术试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

A Rapid Detection Method and Kit for Duck Source Components in Food

The invention provides a rapid detection method and a kit for duck source ingredients in food, which relates to the technical field of biological species identification. The present invention firstly screens out a standard gene LOC106018245 of duck origin, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. The number of copies of LOC106018245 in duck species is constant, and there is no allele variation. It can be used as a target gene for identifying duck origin. The LAMP primers were designed to amplify the gene at constant temperature with the LAMP reaction solution. The LAMP reaction products were used to detect colloidal gold nucleic acid strips. LAMP reaction combined with colloidal gold nucleic acid strip detection constitutes a rapid detection kit, which can quickly and sensitively detect Duck-Derived ingredients in food with a detection sensitivity of 0.2% (w/w). The kit has the advantages of simple use method, low cost, easy observation of reaction results and good specificity, and is very suitable for on-site real-time detection.

【技术实现步骤摘要】
一种食品中鸭源成分快速检测方法及试剂盒
本专利技术涉及生物物种鉴定
，具体的说涉及一种检测食品中鸭源成分的环介导等温扩增技术(LAMP)结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。
技术介绍
随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，鸭中掺杂其他肉类等等行为。目前，对于食品掺假的检测方法主要是PCR方法。PCR方法需要依靠特殊仪器，且最终结果的判断需要琼脂糖凝胶电泳完成，整个过程耗时较长。因此，本专利技术目的是提供一种食品中鸭源成分的快速灵敏检测试剂盒。目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermamplification,LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本专利技术将LAMP技术同胶体金核酸试纸条检测结合起来，提供一种食品中鸭源成分的快速灵敏检测试剂盒。本专利技术无需复杂的仪器，时间短，操作简单，灵敏度高，完全可以满足现场检测的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于检测食品中鸭源成分的鸭源通用内标准基因。本专利技术另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中鸭源成分的LAMP结合胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒。一种用于检测食品中鸭源成分的基因，其为内标准基因LOC106018245，具有SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术提供了上述内标准基因LOC106018245在检测鸭源成分中的应用。本专利技术提供了上述内标准基因LOC106018245在食品中鸭源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了一种用于检测上述内标准基因LOC106018245的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：F3：5’-AGTGTGTGGTAAAAAGGCATG-3’(SEQIDNO.2)；B3：5’-TGAAGGAAAGAGCTCCCG-3’(SEQIDNO.3)；FIP：5’-GATGGTGAGCGGCTTCCTTAGTCCTGAGGGGTAATTTGCA-3’(SEQIDNO.4)；BIP：5’-CAGTGCTTTCCGGCTCAGAGACCTTTAGTCCTTCAGGAACTT-3’(SEQIDNO.5)。其中内引物FIP的5’端标记生物素(Biotin)，BIP的5’端标记荧光素(FITC)。本专利技术提供了上述特异性LAMP引物组合在鸭源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了上述特异性LAMP引物组合在制备鸭源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。进一步地，本专利技术提供一种含有上述特异性LAMP引物组合的检测鸭源成分的快速检测试剂盒。本专利技术提供一种检测食品中鸭源成分的方法，包括以下步骤：(1)待测样品提取DNA；(2)以提取DNA为模板，采用权利要求3所述特异性LAMP引物组合进行LAMP检测；(3)结果判断：采用胶体金核酸试纸条进行结果判断。检测T线和质控C线均有红色条带，含有目的基因；质控C线有红色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因。上述方法中，步骤(2)所述LAMP检测，其25μLLAMP检测体系的具体配置为：1×Thermopolbuffer，0.4mMdNTP，3mMMgSO4，1.0M甜菜碱，1.6μM引物FIP，1.6μM引物BIP，0.2μM引物F3，0.2μM引物B3，8UBstDNA聚合酶大片段。上述方法中，LAMP检测反应条件为：60-65℃恒温20min，85℃5min，然后终止反应。上述方法中，步骤(3)所述的胶体金核酸试纸条包含胶体金核酸试纸条测试线与质控线，测试线标记有FITC抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。本专利技术首次在染色体上筛选出鸭源内标准基因。本专利技术用多个品种鸭验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本专利技术选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。图1为环介导等温扩增与胶体金核酸试纸条检测方法原理图。本专利技术利用LAMP反应，设计4条引物针对鸭特异性内标准基因靶序列6个特异区域来进行等温扩增。在LAMP的内引物FIP与BIP分别标记生物素(Biotin)与荧光素(FITC)。通过LAMP反应即可产生大量的带有生物素与荧光素的双链DNA靶物质。然后用胶体金核酸试纸条检测LAMP反应产物。胶体金核酸试纸条测试线(TL)与质控线(CL)分别标记有FITC抗体和生物素二抗，结合垫有胶体金-生物素抗体标记物。当LAMP反应产物滴加到试纸条样品垫时，由于毛细管作用，产物会依次经过结合垫、检测线(TL)、质控线(CL)，由于“抗原-抗体”的特异性结合作用和胶体金聚沉作用，LAMP反应产物为阳性时，测试线(TL)与质控线(CL)均有红色条带；反应产物为阴性时，则只有质控线(CL)有红色条带。胶体金核酸试纸条是依靠抗原与抗体的特异性结合，因此其具有极高的灵敏度。本专利技术通过将鸭肉肉末与非鸭肉肉末进行梯度等质量的混合，通过LAMP反应结合胶体金核酸试纸条检测以探究本检测方法的灵敏性。结果显示，本专利技术检测试剂盒的检测极限为0.2％(w/w)。基于本专利技术确定的用于检测食品中鸭源成分的内标准基因LOC106018245，本专利技术设计了用于检测该基因的LAMP引物组合，应用LAMP反应结合胶体金核酸试纸条可检测待测样品中是否有鸭源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为环介导等温扩增与胶体金核酸试纸条检测的快速检测试剂盒的原理；图2为鸭特异性内标准基因在16种动物中的LAMP扩增，泳道1为鸭的LAMP产物，1：鸭；2：猪；3：牛；4：绵羊：5：山羊；6：鸡；7：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测食品中鸭源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食品中鸭源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQIDNO.1所示的序列。2.权利要求1所述的基因在检测鸭源成分中的应用。3.权利要求1所述的基因在食品鸭成分鉴定中的应用。4.用于检测权利要求1所述基因的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：F3：5’-AGTGTGTGGTAAAAAGGCATG-3’(SEQIDNO.2)；B3：5’-TGAAGGAAAGAGCTCCCG-3’(SEQIDNO.3)；FIP：5’-GATGGTGAGCGGCTTCCTTAGTCCTGAGGGGTAATTTGCA-3’(SEQIDNO.4)；BIP：5’-CAGTGCTTTCCGGCTCAGAGACCTTTAGTCCTTCAGGAACTT-3’(SEQIDNO.5)。5.权利要求4所述的特异性LAMP引物组合在鸭源成分鉴定中的应用。6.权利要求4所述的特异性LAMP引物组合在制备鸭源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。7.一种检测食品中鸭源成分的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，罗云波，黄昆仑，张超，杜再慧，马玉婷，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11