检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法技术

本发明专利技术提供了检测小鼠细胞，例如NS0或SP2/0细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作不仅简便快捷、灵敏度高，还能区分真核宿主细胞，例如CHO细胞、Vero细胞，毕赤酵母菌、大鼠细胞，特别是人类的干扰性DNA以及原核宿主细胞，例如大肠杆菌的干扰性DNA。

Primers and Methods for Detecting Residual DNA in Mouse Cells

The invention provides a primer pair for detecting genomic DNA of mouse cells, such as NS0 or SP2/0 cells, a kit containing the primer pair, and a method for detecting genomic DNA of mouse cells using the primer pair, which specifically binds to the sequence shown in SEQ ID NO:1. The method of PCR detection using the primer pair is not only simple, fast and sensitive, but also can distinguish eukaryotic host cells, such as CHO cells, Vero cells, Pichia pastoris, rat cells, especially human interfering DNA and prokaryotic host cells, such as E. coli interfering DNA.

【技术实现步骤摘要】
检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法
本专利技术涉及生物检测领域。具体地说，本专利技术涉及小鼠细胞，例如SP2/0或NS0细胞的残留DNA的检测引物及方法。
技术介绍
在现代，生物重组制品，包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于Taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。综上所述，本领域急需检测生物制品中NS0细胞DNA的方法，该方法应具备灵敏性、操作简便、标准统一等优点并且能区分NS0细胞DNA与其它真核宿主细胞DNA，从而能用于生物制品质量控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测生物制品中小鼠细胞基因组DNA，特别是NS0细胞DNA的引物对以及方法。在第一方面，本专利技术提供一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为19-22bp；优选20-21bp；更优选20和21bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在具体的实施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在优选的实施方式中，所述小鼠细胞包括但不限于NS0或SP2/0细胞。在第二方面，本专利技术提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本专利技术第一方面所述的引物对。在具体的实施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:5所示。在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为0.3fg/μl。在优选的实施方式中，所述检测试剂包含的引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述检测试剂包含的探针如SEQIDNO:5所示。在第三方面，本专利技术提供一种检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本专利技术第一方面所述的引物对或本专利技术第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在第四方面，本专利技术提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本专利技术第一方面所述的引物对。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20-21bp；更优选20和21bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:5所示。在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探针如SEQIDNO:5所示。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。在第五方面，本专利技术提供一种PCR方法，包括步骤：在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20-21bp；更优选20和21bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在优选的实施方式中，所述PCR检测体系还包括探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:5所示。在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探针如SEQIDNO:5所示。在第六方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在小鼠细胞DNA。在优选的实施方式中，所述待测对象是重组蛋白制品。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQIDNO:2和3所示；图2显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQIDNO:2和3所示；图3-4显示了利用SEQIDNO:2和3所示引物对进行灵敏度检验的结果；图5显示利用如SEQIDNO:2和3所示引物对获得的碎片化程度不同的DNA片段梯度稀释的qPCR检测结果；图6显示碎片化程度不同的DNA片段的电泳结果；其中，DNA分子量标准：由上至下依次为2000bp、1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-6分别为DNAmarker、0min超声样本、10s超声样本、1min超声样本、10min超声样本、30min超声样本；图7-11显示了利用如SEQIDNO:2和3所示引物对对未超声对照以及超声10s、1min、10min、30min的一系列碎片化程度不同的DNA片段进行qPCR检测的结果；图12-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第1821‑1840位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第1900‑1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90‑110bp。

【技术特征摘要】
1.一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兰，武刚，吴婉欣，宗伟英，朱冰美，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心，湖州申科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11