黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，分子生物学DNA标记技术领域。该微卫星位点的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，微卫星引物的序列为SEQ ID NO：9‑10。本发明专利技术从黄尾鲴基因组DNA中筛选出8个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，所获得引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，可用于黄尾鲴的遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种等领域，使一种可靠有效的分子标记。

Microsatellite Loci, Primers and Their Applications in Yellow-tailed Iris

The invention discloses a microsatellite locus, a primer and its application, and the field of molecular biology DNA marking technology. The nucleotide sequence of the microsatellite locus is SEQ ID NO:1, and the sequence of microsatellite primers is SEQ ID NO:9 10. The invention screens eight microsatellite loci from genomic DNA of the yellow-tailed catfish and designs specific primers according to the flanking sequences of these loci at both ends of the microsatellite loci. The amplified results of the primers obtained have high polymorphism and stability, and can be used in the fields of genetic diversity detection, individual identification and molecular assisted breeding of the yellow-tailed catfish, so as to make a reliable and effective molecular marker. \u3002

【技术实现步骤摘要】
黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用
本专利技术涉及分子生物学DNA标记
，特别涉及黄尾鲴微卫星位点及引物。
技术介绍
黄尾鲴（XenocyprisdavidiBleeker）俗称黄尾、黄片、黄姑子、黄瓜鱼等，隶属于鲤科（Cyprinidae）、鲴亚科（Xenocyprininae）、鲴属（Xenocypris），属底层鱼类，通常生活在江河、湖泊的中下层，尤其喜栖息于多水草、软泥底质的水域底层，是一种中小型淡水鱼类。适应性强，分布广，在我国的长江、珠江、闽江及闽东南各溪流均有分布。由于其具有肉厚、质实，味道鲜美，营养价值高，调控水质等特点，已成为当前水产养殖品种结构调整中首选的优良品种之一，也是水库、湖泊等天然水域增殖放流的理想鱼类。近些年，由于养殖驯化过程中的近亲繁殖、野生资源的过度捕捞以及生存环境的破坏等诸多人为因素的影响，黄尾鲴的野生群体种质资源已经受到了严重的威胁，并逐渐出现了黄尾鲴的养殖群体生长缓慢、规格小，抗逆性能差、性成熟个体变小等问题，制约着我国黄尾鲴养殖业的持续健康发展。国内外在水产养殖物种遗传育种过程中，多采用分子标记辅助育种与常规选择育种相互配合的综合育种技术，分子标记辅助选择使育种技术不断升级、育种效率不断提高。目前，黄尾鲴良种选育技术研究尚处于起步阶段，其分子遗传基础薄弱、基因序列和分子标记资源匮乏，缺乏可用于QTL定位和分子标记辅助育种方面的高质量遗传连锁图谱，严重影响我国黄尾鲴遗传育种计划的开展。因此，迫切需要开展黄尾鲴高效、可靠、多态性高的分子标记开发，对黄尾鲴进行种质资源评价、鉴定及群体遗传学研究，为保障我国黄尾鲴养殖业的健康可持续发展提供理论指导和科学依据。微卫星（Microsatellite）又称为简单序列重复（SimpleSequenceRepeat,SSR），短串联重复（ShortTandemRepeat,STR）或简单序列长度多态性（SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSSLP），是近些年迅速发展起来的一种分子标记，是1-6个碱基串联重复序列，在至今研究的所有生物基因组中均有分布。其原理是利用SSR为引物进行PCR扩增，扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离然后进行多态性分析。在众多分子遗传标记中，微卫星标记具有多态性好、稳定性高、特异性高、共显性遗传、操作简便等特点，成为物种的基因型鉴定与品种保护、种质纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和QTL分析、谱系分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，本专利技术提供了8个黄尾鲴微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为黄尾鲴6种群遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、亲权鉴定、QTL定位等方面提供分子标记。黄尾鲴微卫星位点、引物及其应用，所述黄尾鲴微卫星核苷酸是在高通量测序黄尾鲴转录组获得大量EST(expressedsequencetags)序列的基础上，从EST序列中筛选出了8个微卫星核苷酸序列,8个微卫星核苷酸序列分别是SEQIDNO：1-8。所述微卫星核苷酸序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的核苷酸序列分子。所述黄尾鲴微卫星引物是从序列SEQIDNO：1-8的微卫星重复的侧翼序列上设计的正向、反向引物。所述微卫星引物序列分别为SEQIDNO：9-24。所述微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：表1：8个微卫星位点及对应引物信息位点微卫星序列正向引物名称/序列反向引物名称/序列HWG1SEQIDNO：1SEQIDNO：9SEQIDNO：10HWG2SEQIDNO：2SEQIDNO：11SEQIDNO：12HWG3SEQIDNO：3SEQIDNO：13SEQIDNO：14HWG4SEQIDNO：4SEQIDNO：15SEQIDNO：16HWG5SEQIDNO：5SEQIDNO：17SEQIDNO：18HWG6SEQIDNO：6SEQIDNO：19SEQIDNO：20HWG7SEQIDNO：7SEQIDNO：21SEQIDNO：22HWG8SEQIDNO：8SEQIDNO：23SEQIDNO：24所述的黄尾鲴微卫星引物在黄尾鲴种群遗传多样性检测中的应用，其检测方法包括如下步骤：步骤（1）：基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取黄尾鲴基因组DNA；步骤（2）：微卫星PCR扩增：用微卫星引物扩增基因组DNA，获得黄尾鲴个体微卫星扩增产物；步骤（3）：扩增产物电泳：采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Goldview染色分型；步骤（4）：遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENPOPVersion3.4计算遗传多样性参数；上述的微卫星引物选自序列分别为SEQIDNO：9-24的微卫星引物。有益效果本专利技术从黄尾鲴基因组DNA中筛选出8个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于黄尾鲴的种群遗传多样性检测，亲权鉴定、遗传图谱构建以及分子辅助育种等领域。具体实施方式一、基因组DNA提取：1、用酚抽提法提取黄尾鲴基因组DNA：1)每个个体称取100mg尾鳍于1.5mLEppendorf管中，加入450µLSTE抽提缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0）、35µLSDS（10%）、15µL蛋白酶K（0.2%）。2)颠倒混匀后，将Eppendorf管放入55℃水浴锅中消化3h左右至溶液澄清透明。3)加入RNaseA至终浓度20μg/ml，37℃温浴1h。4)加入700µLTris饱和酚，在DNA混合仪上振荡混匀30min，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中（注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀）。5)在上清液中加入等体积酚仿醇混合物（苯酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1），振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。6)上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸取上清液。7)往步骤6）得到的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。8)用70%乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μLTE（10mmol/LTris-HCl，pH8.0;0.1mmol/LEDTA，pH8.0），室温充分溶解。二、微卫星引物根据黄尾鲴转录组EST-SSR序列，选择了单至三核苷酸不同重复基序的EST-SSR设计、利用软件Primerpremier5设计50对微卫星引物，引物设计主要参数为：引物长度20±2bp，产物的长度为100-500bp；单个引物少于3个核苷酸的互补；保证两个引物的Tm值相差不超过4℃；两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对，(G+C)%含量近似(45%-55%)。以6个黄尾鲴种质（鄱阳湖、军山湖、太泊湖、萍乡、湖南以及养殖）的基因组DNA为模板，对这50对引物进行PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄尾鲴微卫星核苷酸，其特征在于：所述的微卫星核苷酸的序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种黄尾鲴微卫星核苷酸，其特征在于：所述的微卫星核苷酸的序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述的一种黄尾鲴微卫星核苷酸，其特征在于：在微卫星核苷酸的侧翼序列上设计的黄尾鲴微卫星引物，其序列为SEQIDNO：9-10。3.一种利用权利要求2所述黄尾鲴微卫星引物，其特征在于：在黄尾鲴种群遗传多样性检测中的应用。4.一种利用权利要求2所述黄尾鲴微卫星引物进行黄尾鲴种群遗传多样性检测的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕萍，章海鑫，王生，李涵，阙江龙，
申请(专利权)人：江西省水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36