一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于RT

【技术实现步骤摘要】
一种基于RT
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PCR技术检测RB
‑
N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于植物病理学
，具体涉及一种基于RT
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PCR技术检测RB
‑
N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是一种极具经济重要性的病害，各柑橘产区均有发生，该病主要通过接穗和蚜虫进行扩散和传播，严重影响着柑橘的产量和品质，对全世界柑橘产业造成了严重的威胁。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子呈11
×
2,000nm的长线形，基因组约19,300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV存在多种基因型和复杂的株系分化现象，不同基因型的CTV分离株能引起包括茎陷点、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在内的多种症状。目前CTV被分为T3、VT、T30、T36、B165、RB、L1、M1、S1、HA165、T68、AT
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1等10余种基因型，其中T30基因型CTV分离株为弱毒株系，T36基因型CTV分离株能引起柑橘植株的速衰症状，T3、VT、B165基因型CTV分离株主要引起苗黄症状，RB、HA基因型CTV分离株可能与茎陷点症状相关。为此，Hilf、Roy等人针对此现象设计了特异性引物并运用RT
‑
PCR技术区分上述基因型CTV分离株，Yokomi等人根据CP基因设计的三种探针可区分T36、VT、T30基因型的CTV分离株。
[0003]申请人在前期研究中发现，CTV分离株中还存在一种新的基因型(RB
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N1基因型)，RB
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N1基因型的CTV分离株序列与目前报道的引起柑橘植株茎陷点症状的CTV的RB基因型分离株的序列同源性高达86.5％，因此RB
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N1基因型CTV分离株对拓展研究CTV分离物基因型类型和在各柑橘产区的分布情况以及与CTV分离物引起柑橘植株症状间的相关性有重要意义。到目前为止，还没有关于CTV分离株RB
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N1基因型的相关报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于RT
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PCR技术检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法，对RB
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N1基因型柑橘衰退病毒具有快速、高效、特异性强和灵敏度高的检测特点。
[0005]本专利技术提供了一种检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB
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N1F和RB
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N1R2；
[0006]所述RB
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N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0007]所述RB
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N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本专利技术提供了一种基于RT
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PCR技术检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，包括所述引物对。
[0009]优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。
[0010]优选的，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；
[0011]所述荧光PCR扩增用试剂包括2
×
SYBR Green qPCRMix；
[0012]所述普通PCR扩增用试剂包括10
×
PCR
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buffer、dNTPs和r
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Taq酶。
[0013]优选的，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5
×
RT
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buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。
[0014]本专利技术提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB
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N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。
[0015]本专利技术提供了一种基于RT
‑
PCR技术检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒感染的方法，包括以下步骤：
[0016]1)提取待检测样品的RNA；
[0017]2)将步骤1)中RNA进行反转录，得到cDNA；
[0018]3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0019]4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB
‑
N1基因型柑橘衰退病毒的结果。
[0020]优选的，所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增；
[0021]所述普通PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；
[0022]所述荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性20s；95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。
[0023]优选的，根据PCR扩增的方法进行片段分析：当采用普通PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若得到的条带为524bp，表示待测样品感染RB
‑
N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB
‑
N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
[0024]优选的，当采用荧光PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测，所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰，说明待测样品感染RB
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N1基因型柑橘衰退病毒，反之则没有感染或待检测样品感染RB
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N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
[0025]本专利技术提供的检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB
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N1F和RB
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N1R2；所述RB
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N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述RB
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N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本专利技术针对柑橘衰退病毒新型基因型毒株，设计一对特异性检测引物对RB
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N1F/RB
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N1R2，所述引物对仅针对RB
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N1基因型能实现扩增，而对柑橘衰退病毒的其他基因型毒株(T36、RB、T3)均不能实现扩增，表明，所述引物对具有较高的检测特异性。
[0026]本专利技术提供了一种基于RT
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PCR技术检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，所述试剂盒具有操作简单快速、检测过程高效等特点。采用所述试剂盒检测时，采用不同浓度cDNA进行PCR扩增，扩增曲线显示cDNA稀释梯度至1.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，其特征在于，包括RB
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N1F和RB
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N1R2；所述RB
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N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述RB
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N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种基于RT
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PCR技术检测RB
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N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对。3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；所述荧光PCR扩增用试剂包括2
×
SYBRGreenqPCRMix；所述普通PCR扩增用试剂包括10
×
PCR
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buffer、dNTPs和r
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Taq酶。5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5
×
RT
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buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。6.权利要求1所述引物对或权利要求2～5任意一项所述试剂盒在检测柑橘植株感染RB
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N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。7.一种基于RT
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PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：易龙，李双花，周俊，黄爱军，苏华楠，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：