检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2-E627K突变的引物和探针及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2

【技术实现步骤摘要】
检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的引物和探针及检测方法


[0001]本专利技术属于包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法
，具体涉及一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]H5亚型禽流感病毒严重威胁着家禽养殖业和人类健康。2021年之前H5N8禽流感病毒只在野鸟和家禽中流行和传播，2021年2月俄罗斯向世界卫生组织报告世界首例人感染H5N8禽流感病例，H5N8禽流感病毒对人类健康威胁进一步加大。
[0003]禽流感病毒的致病性和跨种传播与病毒的重组和变异密切相关，研究表明禽流感病毒PB2基因E627K突变可以影响病毒的致病性和跨种传播，PB2
‑
E627K突变被认为是禽流感病毒的致病性增强和跨种传播的分子标记。因此检测H5N8禽流感病毒PB2
‑
E627K突变，对于评估H5N8禽流感病毒致病性和跨种传播风险具有重大意义，但目前尚未有相关检测试剂报道。
[0004]本专利技术提供的引物和探针能够对H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变进行检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种检测H5N8亚型禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针包括：
[0007]H5N8禽流感病毒HA基因(he5aggluti5i5，血凝素基因)检测引物和探针：
[0008]HA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1：5
’‑
cgaattcatcagagtgccgg
‑3’
[0009]HA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5
’‑
tccctggtatggacaagctg
‑3’
[0010]HA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3：5
’‑
FAM
‑
tccctggtatggacaagctg
‑
BHQ1
‑3’
[0011]H5N8禽流感病毒NA基因(Neura5i5idase，神经氨酸酶基因)检测引物和探针：
[0012]NA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4：5
’‑
tccctggtatggacaagctg
‑3’
[0013]NA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5:5
’‑
aacccgaaaccttttacgcc
‑3’
[0014]NA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6:5
’‑
ROX
‑
aacccgaaaccttttacgcc
‑
BHQ2
‑3’
[0015]H5N8禽流感病毒PB2基因E627K突变检测引物和探针：
[0016]PB2
‑
627E正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7：5
’‑
atttgcagcagccccatcag
‑3’
[0017]PB2
‑
627K正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8：5
’‑
atttgcagcagcccccctga
‑3’
[0018]PB2基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9:5
’‑
agactccactcctgctgttc
‑3’
[0019]PB2基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10:5
’‑
CY5
‑
ggcgccttgacagaatatcc
‑
BHQ3
‑3’
。
[0020]第二方面，本专利技术提供上述检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针在制备检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒中的应用。
[0021]第三方面，本专利技术提供一种检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针。
[0022]按上述方案，所述试剂盒包括独立包装的PCR反应A1液、PCR反应A2液，以及PCR反应B液；
[0023]所述PCR反应A1液包括用于检测H5N8 PB2
‑
627E禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2
‑
627E正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
[0024]所述PCR反应A2液包括用于检测H5N8 PB2
‑
627K禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2
‑
627K正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；
[0025]所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。
[0026]进一步的，所述PCR反应A1液、PCR反应A2液还包括dNTP Mixture和PCR buffer。
[0027]进一步地，所述试剂盒还包括：
[0028]阳性对照，阳性对照含有H5N8禽流感病毒HA基因、NA基因、PB2
‑
627E和PB2
‑
627K基因的扩增序列质粒的混合液；
[0029]阴性对照：RNase Free Water。
[0030]本专利技术的第四方面提供上述检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变病毒中的应用。
[0031]本专利技术的第五方面提供一种H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的荧光PCR检测方法，所述方法包括如下的步骤：
[0032]以所提取待检测样本的RNA为模板，配置扩增反应体系并进行荧光PCR扩增，每管PCR扩增同时检测FAM、ROX和CY5荧光信号，即同时检测H5N8禽流感病毒的HA基因、NA基因和PB2基因，实时记录所述PCR扩增过程中的Ct值和PCR扩增曲线，对PCR扩增曲线进行分析并做出判断；
[0033]所述待检测样包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针，其特征在于，所述特异性引物和探针包括：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针：HA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1：5
’‑
cgaattcatcagagtgccgg
‑3’
HA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5
’‑
tccctggtatggacaagctg
‑3’
HA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3：5
’‑
FAM
‑
tccctggtatggacaagctg
‑
BHQ1
‑3’
H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针：NA基因正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4：5
’‑
tccctggtatggacaagctg
‑3’
NA基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5:5
’‑
aacccgaaaccttttacgcc
‑3’
NA基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6:5
’‑
ROX
‑
aacccgaaaccttttacgcc
‑
BHQ2
‑3’
H5N8禽流感病毒PB2基因E627K突变检测引物和探针：PB2
‑
627E正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7：5
’‑
atttgcagcagccccatcag
‑3’
PB2
‑
627K正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8：5
’‑
atttgcagcagcccccctga
‑3’
PB2基因反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9:5
’‑
agactccactcctgctgttc
‑3’
PB2基因荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10:5
’‑
CY5
‑
ggcgccttgacagaatatcc
‑
BHQ3
‑3’
。2.一种权利要求1所述的检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针在制备检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒中的应用。3.一种检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测H5N8禽流感病毒及其PB2
‑
E627K突变的特异性引物和探针。4.根据权利要求3所述的检测H5N8禽流感病毒及PB2
‑
E627K突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装的PCR反应A1液、PCR反应A2液，以及PCR反应B液；所述PCR反应A1液包括用于检测H5N8 PB2
‑
627E禽流感病毒的引物和探针：H5N8禽流感病毒HA基因检测引物和探针、H5N8禽流感病毒NA基因检测引物和探针、PB2
‑
627E正向引物、PB2基因反向引物以及PB2基因荧光探针；所述PCR反应A2液包括用于检测H5N8 PB2
‑
627K禽流感病毒的引物和...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗正，刘丽娜，郭振东，张春茂，夏咸柱，高玉伟，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：