【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测，具体涉及一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时定量rt-pcr检测用引物、试剂盒和方法。
技术介绍
1、柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒(citrus tristezavirus，ctv)引起的威胁柑橘产业健康可持续发展的严重病害。ctv是长线科(closteroviridae)长线形属(closterovirus)的成员。ctv粒子由一个约19.3kb的单链正义rna(+ssrna)和两个分别为25kda(p25)和27kda(p27)的外壳蛋白组成。ctv存在复杂的基因型分化现象。根据ctv基因组的系统演化关系，目前ctv已有11种基因型被鉴定，包括vt、t30、t36、t3、a18、b165(t68)、rb、ha(ha16-5)、s1、l1及m1。研究发现rb和vt基因型分离物是我国发生最为普遍的基因型，两者混合侵染与我国柑橘衰退病爆发高度相关。目前已初步明确vt基因型分离物具有高致病性，可在葡萄柚和甜橙上引起严重速衰、苗黄和茎陷点症状。rb分离物致病性较弱，尽管可突破枳及其杂交种对ctv的抗性，但仅可引起轻微的茎陷点症状。田间样品中rb基因型、vt基因型常混合侵染，引起较为严重的症状，为了评估两者的为害程度和鉴定其致病性，需要快速、准确的检测和定量两种基因型。
2、生物学中用于定量检测的方法有实时荧光定量技术、转磷光免疫层析技术等。目前实时荧光定量rt-pcr技术在定量检测技术中的使用最广泛。实时荧光定量的化学原理包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的
3、目前，最常用的ctv基因型鉴定方法有4种。第一种是利用限制性内切酶hinfⅰ对ctv的外壳蛋白基因扩增产物在37℃下进行消化，根据消化后不同片段长度的图谱分为7个组群，结合ctv在指示植物上表现的不同生物学症状，将7个组群划分为潜在的弱毒株系和强毒株系；但该方法无法将7个rflp组群与ctv基因型对应，且逐渐发现越来越多无法归类的组群出现，导致该方法的应用越来越少。第二种是通过比较ctv 5′端基因组5′urt、k17及pol区域的序列差异，设计了10对引物用于检测vt、t30、t3和t36基因型；该方法较为繁琐，且同样存在无法归类的ctv分离物。第三种是roy等设计的检测b165、vt、t30、t3和t36基因型的特异性检测引物，是目前较为常用的ctv基因型检测体系之一。但以上检测鉴定方法程序复杂、耗时较长，而且结果判定过程复杂、常常出现污染，给ctv基因型检测带来困扰。因此，建立针对rb和vt基因型的高效的检测和定量方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时定量rt-pcr检测用引物、试剂盒和方法。本专利技术所述引物用于rb和vt基因型的单重或双重实时荧光rt-pcr检测，耗时短且结果判定直观，准确且能实现定量检测，可大大提高rb和/或vt基因型检测鉴定效率。
2、本专利技术提供了一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时荧光rt-pcr检测用引物，检测rb基因型的引物包括rb qf2和rb qr2，检测vt基因型的引物包括vt qf3和vt qr3；所述rb qf2的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述rb qr2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述vt qf3的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述vt qr3的核苷酸序列如seq idno.4所示。
3、本专利技术还提供了一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时荧光rt-pcr检测用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和反应液。
4、优选的是，所述试剂盒还包括检测内参基因的内参引物，所述内参基因为柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因；所述内参引物包括actb f和actb r，所述actb f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述actb r的核苷酸序列如seq id no.6所示。
5、本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物或上述技术方案所述试剂盒检测柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型的实时荧光rt-pcr方法，包括以下步骤：
6、提取待测样品核酸，使用上述技术方案所述引物对柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型进行单重或双重的实时荧光rt-pcr检测。
7、优选的是，当进行单重的实时荧光rt-pcr检测时，所述方法以柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因为内参基因，对柑橘衰退病毒rb或vt基因型进行相对定量分析。
8、优选的是，当进行单重实时荧光rt-pcr检测时，反转录的反应体系每20μl包括：3μl总rna、1μl 10mm的dntp、1μln6 primer、4μl 5×es buffer、1μleasyscript@rt、0.5μlribonuclease inhibitor和9.5μlddh2o；反转录的反应程序为：42℃反转录30min。
9、优选的是，反转录后，反应体系每10μl包括5μl 2×perfectstart green qpcrsupermix、4μl dd h2o、0.25μl 10μm的rb qf2和0.25μl 10μm的rb qr2，或0.25μl 10μm的vt qf3和0.25μl 10μm的vt qr3和0.5μl cdna。
10、优选的是，当进行单重实时荧光rt-pcr检测柑橘衰退病毒rb基因型时，反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、57℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0.5℃和记录一次荧光信号。
11、优选的是，当进行单重实时荧光rt-pcr检测柑橘衰退病毒vt基因型时，反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、59℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0.5℃和记录一次荧光信号。
12、优选的是，当进行双重实时荧光rt-pcr检测时，反转录后，反应体系每10μl包括5μl 2×perfectstart greenqpcr supermix、3.5μldd h2o、0.25μl 10μm的rb qf2、0.25μl10μm的rb qr2、0.25μl 10μm的vt qf3、0.25μl 10μm的vt qr3和0.5μl cdna；反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、57℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种柑橘衰退病毒RB和/或VT基因型实时荧光RT-PCR检测用引物，其特征在于，检测RB基因型的引物包括RB qF2和RB qR2，检测VT基因型的引物包括VT qF3和VT qR3；所述RBqF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RB qR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述VT qF3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述VT qR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种柑橘衰退病毒RB和/或VT基因型实时荧光RT-PCR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和反应液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的内参引物，所述内参基因为柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因；所述内参引物包括ACTB F和ACTB R，所述ACTB F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述ACTB R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
4.一种基于权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒检测柑橘衰退病毒RB和/或VT基因型的实时荧光RT-PCR方法
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当进行单重的实时荧光RT-PCR检测时，所述方法以柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因为内参基因，对柑橘衰退病毒RB或VT基因型进行相对定量分析。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当进行单重实时荧光RT-PCR检测时，反转录的反应体系每20μL包括：3μL总RNA、1μL 10mM的dNTP、1μL N6 Primer、4μL 5×ESbuffer、1μL EasyScript@RT、0.5μL Ribonuclease Inhibitor和9.5μLddH2O；反转录的反应程序为：42℃反转录30min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反转录后，反应体系每10μL包括5μL 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix、4μL dd H2O、0.25μL 10μM的RB qF2和0.25μL 10μM的RB qR2，或0.25μL 10μM的VT qF3和0.25μL 10μM的VT qR3和0.5μL cDNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行单重实时荧光RT-PCR检测柑橘衰退病毒RB基因型时，反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、57℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0.5℃和记录一次荧光信号。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行单重实时荧光RT-PCR检测柑橘衰退病毒VT基因型时，反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、59℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0.5℃和记录一次荧光信号。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当进行双重实时荧光RT-PCR检测时，反转录后，反应体系每10μL包括5μL 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix、3.5μL dd H2O、0.25μL 10μM的RB qF2、0.25μL 10μM的RB qR2、0.25μL 10μM的VT qF3、0.25μL 10μM的VTqR3和0.5μL cDNA；反转录后，扩增程序为：95℃预变性30s；95℃10s、57℃20s、72℃20s，40个循环；熔解65℃～95℃，其中每5s增加0.5℃和记录一次荧光信号。
...【技术特征摘要】
1.一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时荧光rt-pcr检测用引物，其特征在于，检测rb基因型的引物包括rb qf2和rb qr2，检测vt基因型的引物包括vt qf3和vt qr3；所述rbqf2的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述rb qr2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述vt qf3的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述vt qr3的核苷酸序列如seq id no.4所示。
2.一种柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型实时荧光rt-pcr检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和反应液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的内参引物，所述内参基因为柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因；所述内参引物包括actb f和actb r，所述actb f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述actb r的核苷酸序列如seq idno.6所示。
4.一种基于权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒检测柑橘衰退病毒rb和/或vt基因型的实时荧光rt-pcr方法，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当进行单重的实时荧光rt-pcr检测时，所述方法以柑橘肌动蛋白解聚因子的编码基因为内参基因，对柑橘衰退病毒rb或vt基因型进行相对定量分析。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当进行单重实时荧光rt-pcr检测时，反转录的反应体系每20μl包括：3μl总rna、1μl 10mm的dntp、1μl n6 primer、4μl 5×esbuffer、1μl easyscript@rt、0.5μl ribonuclease inhibitor和9.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，韩镕琰，张晓男，易龙，杨欣悦，方书洁，郭雪扬，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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