一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒及其检测方法，本发明专利技术属于生物检测技术领域，所述试剂盒包括：crRNA、T7转录酶、NTP、探针、Cas13a和核酸扩增试剂；所述核酸扩增试剂包括引物对，所述引物对选自如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列，和/或如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列；所述crRNA选自如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核酸序列。该试剂盒可用于非诊断治疗目的的口蹄疫病毒检测，该方法具有极高的特异性和灵敏度，为基于恒温扩增的重大动物疫病的检测试剂的制备和生产提供参考。制备和生产提供参考。制备和生产提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot
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and
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mouth disease virus，FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄类动物的急性、恶性、高接触性传染病，一旦爆发，必须扑杀感染及接触感染的动物。口蹄疫被世界动物卫生组织列为法定报告疾病，被我国列为一类动物疫病之首，不仅会造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。
[0003]口蹄疫有7种血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。口蹄疫主要包括A型、O型、C型、亚洲I型、南非1/2/3型(SAT1/2/3)共7种血清型。由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成环境生物污染和传染病传播，因此对于病毒的检测具有很高的需求。
[0004]对于病毒检测，通常使用核酸检测方法，但目前的核酸检测方法的仍然存在多方面的不足。反转录
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聚合酶链反应(reverse transcription
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polymerase chain reaction，RT
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PCR)和荧光RT
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PCR需要特定温度循环的扩增仪器，不便于实现现场检疫。目前应用广泛的恒温扩增技术如环等温扩增技术(Loop
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mediated isothermalamplification，LAMP)与重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)等可以满足现场检测的需求，但是由于LAMP其特异性方面的缺陷容易导致假阳性，RAA对引物的设计非常敏感，需要从多对引物中筛选才能达到高灵敏度检测的要求。
[0005]因此，开发新的口蹄疫病毒的检测方法，同时满足方便现场检疫和检测灵敏度的需求，具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒，能够在恒温条件下进行检测，降低对荧光PCR检测设备的依赖，且具有较高的检测灵敏度。
[0007]本专利技术还提出上述试剂盒的使用方法。
[0008]本专利技术还提出上述试剂盒在非诊断治疗目的的口蹄疫病毒检测中的应用。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提出了一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括：crRNA、T7转录酶、NTP、探针、Cas13a和核酸扩增试剂；
[0010]所述核酸扩增试剂包括引物对，所述引物对选自如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列，和/或如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列；所述crRNA选自如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核酸序列。
[0011]在本专利技术中，引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，以及crRNA：SEQ ID No.5，用于检测亚洲I型、SAT1/2/3和C型FMDV毒株；引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，以及crRNA：SEQ ID No.6，用于检测O型和A型FMDV毒株。由于病毒序列变异较大，因此使用两套引物来实现对口蹄疫不同分型毒株检测的全覆盖。
[0012]根据本专利技术的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：该试剂盒通过恒温扩增结合Cas13a的方法可以实现高灵敏度检测；其中，Cas13a蛋白识别并能结合了其靶RNA序列后可以被激活，活化的Cas13a可以分解所处环境中的非靶标RNAs，Cas13a介导的报告RNA的非特异性断裂可以用来检测恒温扩增的目的核酸序列，该检测技术的优势主要表现在检测结果具有变异性低和灵敏度高等特点。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述探针为FAM
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UUUUUUUUUUUUUU
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TAMRA，其中，FAM和TAMRA为荧光基团。在另一些实施例中，所述荧光基团还可以选择TET、HEX、Cy3、Cy5、ROX中的至少一种。所述探针可以适用于本专利技术的所有检测体系，具有广泛的适用范围和较高的灵敏度。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂还包括RPA或RAA的扩增试剂。
[0015]在本专利技术中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)和重组酶介导的扩增技术(recombinase
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aidamplification，RAA)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，RPA体系的重组酶来源于T4噬菌体，RAA体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本专利技术的一些实例中，均可购买商业化的RPA或RAA体系的核酸扩增试剂进行反应。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述crRNA的浓度为10μM，所述T7转录酶的浓度为1mg/mL，所述NTP的浓度为100mM，所述探针的浓度为10μM，所述Cas13a的浓度为1mg/mL。上述浓度均为各组分在体系内的终浓度。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括：反应缓冲液和水。
[0018]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述反应缓冲液包括终浓度为40mM Tris
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HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2和pH 7.3的缓冲液。
[0019]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述试剂盒包括：crRNA 1μL、T7转录酶1.5μL、NTP 4μL、探针2.5μL、Cas13a 0.5μL、核酸扩增产物2.5μL、反应缓冲液2.5μL和水11μL；所述核酸扩增产物通过所述核酸扩增试剂扩增得到。
[0020]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述试剂盒包括：crRNA 1μL(浓度为10μM)、T7转录酶1.5μL(浓度为1mg/mL)、NTP 4μL(浓度为100mM)、探针2.5μL(浓度为10μM)、Cas13a 0.5μL(浓度为1mg/mL)、核酸扩增产物2.5μL、反应缓冲液2.5μL和水11μL；所述核酸扩增产物使用RPA或RAA的系统进行扩增，和/或通过苯酚氯仿法纯化得到。上述浓度均为各组分在体系内的终浓度。
[0021]根据本专利技术的再一个方面，提出了所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0022]S1、通过所述核酸扩增试剂得到核酸扩增产物；
[0023]S2、将所述核酸扩增产物与crRNA、T7转录酶、NTP、探针和Cas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于口蹄疫病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：crRNA、T7转录酶、NTP、探针、Cas13a和核酸扩增试剂；所述核酸扩增试剂包括引物对，所述引物对选自如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列，和/或如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列；所述crRNA选自如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括RPA或RAA的扩增试剂。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA的浓度为10μM，所述T7转录酶的浓度为1mg/mL，所述NTP的浓度为100mM，所述探针的浓度为10μM，所述Cas13a的浓度为1mg/mL。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：反应缓冲液和水。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：crRNA 1μL、T7转录酶1.5μL、NTP 4μL、探针2.5μL、Cas13a 0.5μL、核酸扩增产物2.5μL、反应缓冲液2.5μL和水11μL；所述核酸扩增产物通...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛俊欣，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：