【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物检疫，具体为涉及一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂、试剂盒，及采用该试剂或试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用。
技术介绍
1、南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus，armv)为线虫传多面体病毒属(nepovirus)病毒，病毒粒子为等径二十面体，直径约30nm，无包膜。在自然条件下，armv主要经汁液摩擦和介体线虫传播，传播介体主要为异尾剑线虫(xiphinemadiversicaudatum)。也可通过种子及种球、块茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播，在许多寄主上种传率超过10％。armv广泛分布于欧洲10多个国家，美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本、南非等也有报道，能自然侵染并危害多种瓜类、豆类、花卉和果树，引起花叶黄化褪绿、矮化、皱缩甚至坏死等症状，是我国的进境植物检疫性有害生物。
2、病毒的早期诊断有利于及时制定合理控制策略，防止危险病害进一步传播扩散。鉴于armv寄主范围广、随种苗传播的风险较大，为防止该病毒进入并在我国为害，建立一整套快速、有效的方法显得十分必要。
3、目前，南芥菜花叶病毒的检测方法主要包括elisa、rt-pcr和实时荧光taqman-mgb探针rt-pcr、交叉引物等温扩增等检测方法。但这些方法都存在局限性，elisa方法检出限低，难以实现无症状植物中少量病毒的检测，且elisa方法常常无法鉴别病毒种类，特异性差，而基于pcr技术的检测方法存在反应时间长、需要昂贵的热循环仪器和专业的操作人员等缺陷。交叉
4、rpa-lfd是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记、分子杂交和侧向流层析等方法相结合的技术，rpa(recombinase polymerase amplification)，即重组酶聚合酶扩增技术；lfd(lateral flow stripe device)，即侧流免疫层析试纸条。rpa-lfd为一种等温核酸扩增技术，可在常温下进行反应，具有反应快、灵敏度高、特异性强、操作简便、结果可视化等优点。但，rpa-lfd存在技术瓶颈，其中最重要的技术瓶颈是引物和探针没有明确的设计原则，探针长度和探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，研究者需要设计不同的引物和探针，增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本，影响该方法的灵敏度和特异性。而且，rpa-lfd目前主要应用于人类、畜禽及实验动物的病原体检测，在侵染植物的病毒检测中应用较少。
5、本申请旨在建立南芥菜花叶病毒rpa-lfd检测方法，以解决基层单位方便、快速检测的问题。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术提供一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，采用该试剂结合rpa-lfd，可将包括rna提取和rpa反应的整个检测过程控制在40min内，缩短了反应时间，也不需要昂贵的仪器，可在简易实验室和田间即可完成快速检测。为此，本专利技术还提供了一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒；另外，本专利技术还提供了一种检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的方法。
2、本专利技术的第一方面，提供一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自seq id no:1或seqid no:2所示核苷酸序列；其中下游引物选自seq id no:3所示核苷酸序列；其中探针选自seq id no:4所示核苷酸序列。
3、作为优选的实施例，所述上游引物对应的序列为：
4、5’-ggtcttgctggtagaggttctgtccaggt-3’
5、或5’-agtgggttttcaggtattcagtatgaaaagtgga-3’；
6、所述下游引物对应的序列为：5’-ttgttatttccagtgaggcatgtgaaatg-3’；
7、所述探针对应的序列为：
8、fam-gccaatgccctcacgggtattacgtgggttatgag-thf-tttga tgcctata-c3spacer。
9、作为更为优选的实施例，所述探针距3’端13个碱基之处的胞嘧啶用四氢呋喃替换。
10、本专利技术的第二方面，提供一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒，该试剂盒包括上述的试剂。
11、本专利技术的第三方面，提供上述的试剂或试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用。
12、本专利技术的第四方面，提供一种检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的rpa-lfd方法，包括如下步骤：
13、s1，从待测样品中提取总rna；
14、s2，以总rna为模板，用特异性引物对和探针进行rt-rpa反应，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物选自seq id no:1或seq id no:2所示核苷酸序列；其中下游引物选自seq id no:3所示核苷酸序列；所述探针选自seq id no:4所示核苷酸序列；
15、s3，将反应后的溶液加入试纸条，2-5min后观察试纸条；
16、若试纸条质控区出现一条红色检测线，检测区无检测线出现，则待测样品没有被南芥菜花叶病毒侵染；
17、若试纸条质控区出现一条红色检测线，检测区也出现一条红色检测线，则待测样品被南芥菜花叶病毒感染。
18、作为优选的实施例，所述上游引物和下游引物在rt-rpa反应的终浓度为0.1μm-0.5μm。
19、作为优选的实施例，所述探针在rt-rpa反应的终浓度为0.06μm-0.3μm。
20、作为优选的实施例，所述rt-rpa反应的反应温度为34-42℃。
21、作为优选的实施例，所述rt-rpa反应的反应时间为8-10min。
22、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
23、(1)本专利技术检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的rpa-lfd方法，可将整个检测过程控制在40min内，缩短了反应时间，也不需要昂贵的仪器，可在简易实验室和田间完成快速检测。
24、(2)本专利技术检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种南芥菜花叶病毒RPA-LFD可视化快速检测的试剂，其特征在于，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；其中下游引物选自SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；其中探针选自SEQ ID NO:4所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述上游引物对应的序列为：
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针距3’端13个碱基之处的胞嘧啶用四氢呋喃替换。
4.一种南芥菜花叶病毒RPA-LFD可视化快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的试剂。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用。
6.一种检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物在RT-RPA反应的终浓
8.根据权利要求6所述的检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述探针在RT-RPA反应的终浓度为0.06μM-0.3μM。
9.根据权利要求6所述的检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述RT-RPA反应的反应温度为34-42℃。
10.根据权利要求6所述的检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述RT-RPA反应的反应时间为8-10min。
...【技术特征摘要】
1.一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，其特征在于，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自seq id no:1或seq id no:2所示核苷酸序列；其中下游引物选自seq id no:3所示核苷酸序列；其中探针选自seq id no:4所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述上游引物对应的序列为：
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针距3’端13个碱基之处的胞嘧啶用四氢呋喃替换。
4.一种南芥菜花叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的试剂。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有南芥菜花叶病毒中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：于翠，费静，于子翔，田沂民，李友军，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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