【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，尤其涉及一种牛睾丸类器官的构建方法。
技术介绍
1、睾丸在雄性生物中有两个主要作用：配子生成和产生雄激素。曲细精管管壁由支持细胞及各级生精细胞形成的内部生精上皮和管周肌样细胞形成的外层组成，精原干细胞(spermatogonial stem cells，sscs)作为未分化的精原细胞，能持续产生大量精子，是精子发生的基础。支持细胞(sertoli cells,scs)是生殖细胞分化的场所饲育细胞，相邻scs支持细胞之间的紧密连接是血睾屏障的主要组成部分。此外，睾丸间质中存在间质细胞(leydig cells，lcs)其分泌的睾酮可启动胎儿性腺的雄性化，并维持性成熟后期的精子发生过程。精子发生的效率依赖于scs支持细胞-精原干细胞sscs生态位，它能够使发育中的生殖细胞在空间上正确的排列，并接收sscs自我更新和分化所需的各种信号和细胞因子。
2、家畜雄性育种及种质保存是生殖医学及生物学中的重要的课题。牛是重要的经济动物，但一些遗传性因素如隐睾、睾丸发育不全，免疫性及疾病等的因素会导致公牛繁殖障碍，而针对这个此问题的研究需要大量实验动物，费用十分昂贵，而缺乏对睾丸和精子发生调控全面的了解，阻碍了我们对雄性不育及其诊断和治疗的研究。因此，在体外建立一个能够再现睾丸内多细胞间复杂的通讯的模型对于研究睾丸功能及揭示雄性不育是十分关键的。
3、类器官是指源自原代组织或干细胞的体外三维(3d)立体微型细胞簇，并具有某些特异性细胞类型、结构和功能的器官样结构。目前关于睾丸类器官的研究十分有限，
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种牛睾丸类器官的构建方法，以解决体外构建大家畜多细胞间通讯模型的技术问题。
2、为实现上述目的，本专利技术的一种牛睾丸类器官的构建方法的具体技术方案如下：
3、一种牛睾丸类器官的构建方法，包括以下步骤：
4、步骤s1：采取睾丸组织
5、采取1日龄荷斯坦犊牛睾丸，无菌操作去除多余组织，将睾丸实质剪至1cm3左右，用含1％双抗的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,pbs)溶液清洗；
6、步骤s2：分离纯化原代细胞
7、将睾丸实质置于离心管中剪碎至糊状，二步酶消化法将睾丸组织消化成单细胞；根据细胞不同的性质，使用差异贴壁法纯化细胞，贴壁细胞为睾丸体细胞如睾丸间质细胞(leydig cells，lcs)和支持细胞(sertoli cells，scs)，而精原干细胞(spermatogonialstem cells，sscs)悬浮在培养液中，37℃、5％co2中培养；
8、步骤s3：进一步纯化细胞
9、培养至皿中形成sscs克隆时，用玻璃针挑取细胞克隆至新的培养皿中，多次传代扩大培养；使用percoll法纯化lcs和scs；
10、步骤s4：标记细胞
11、用vybrant cell-labeling试剂分别将sscs、lcs及scs标记为不同的颜色，按比例将3种细胞混合后接种到超低吸附96孔板中，37℃、5％ co2中继续培养；
12、步骤s5：观察细胞
13、未成熟的睾丸细胞不受环境的影响具有自主装的功能，可通过荧光显微镜观察类器官形态及标记的细胞的分布。
14、进一步，所述步骤s2中，二步酶消化法所用消化液配方包括消化液i和消化液ii；
15、所述消化液i为1mg/ml胶原酶ⅳ、5μg/ml脱氧核糖核酸酶i，dnase i的f12溶液；
16、所述消化液ii为1mg/ml胶原酶ⅳ、1mg/ml透明质酸酶、5μg/ml dnase i和1mg/ml胰酶。
17、进一步，所述步骤s2中，将剪碎的组织先置于消化液i中37℃消化30min,1500rpm离心5min；弃上清后在消化液ii中继续消化，直至可见单细胞时加入等体积胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)终止消化。
18、进一步，所述步骤s3中，使用percoll法纯化lcs和scs具体包括以下内容：
19、将percoll原液与10％pbs按照9∶1的比例混合得到100％percoll溶液，以1×pbs溶液稀释可得到目的percoll分离液，按表配制不同浓度梯度的percoll分离液，按照从大到小的密度依次缓慢加入到15ml离心管中；收集培养的睾丸体细胞，用2ml培养基重悬，并缓慢加入到离心管最上层，4℃、4000rpm/min离心50min，密度为1.080处的细胞为lcs，其余层的细胞为scs，接种到培养皿中继续培养。
20、进一步，所述步骤s4中，按照sscs∶scs∶lcs＝8∶1∶1的比例混合，以1×104个/40μl的浓度接种到超低吸附96孔板中，37℃、5％ co2中继续培养。
21、本专利技术的一种牛睾丸类器官的构建方法具有以下优点：本专利技术在研究大家畜生殖系统生态位生精微环境、雄性不育及其诊断和治疗方面具有重要意义，并为后续的睾丸类器官应用奠定了基础。
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1.一种牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，二步酶消化法所用消化液配方包括消化液I和消化液II；
3.根据权利要求2所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，将剪碎的组织先置于消化液I中37℃消化30min,1500rpm离心5min；弃上清后在消化液II中继续消化，直至可见单细胞时加入等体积胎牛血清终止消化。
4.根据权利要求1所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，使用Percoll法纯化睾丸间质细胞和支持细胞具体包括以下内容：
5.根据权利要求1所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，按照精原干细胞∶支持细胞∶睾丸间质细胞＝8∶1∶1的比例混合，以1×104个/40μL的浓度接种到超低吸附96孔板中，37℃、5％CO2中继续培养。
【技术特征摘要】
1.一种牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤s2中，二步酶消化法所用消化液配方包括消化液i和消化液ii；
3.根据权利要求2所述的牛睾丸类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤s2中，将剪碎的组织先置于消化液i中37℃消化30min,1500rpm离心5min；弃上清后在消化液ii中继续消化，直至可见单细胞时加...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学明，杨蕊，张博洋，陈斓歆，张言，王玥琦，蒋道臻，唐博，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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