【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株高产l-苯丙氨酸的菌株构建及其应用，属于生物工程。
技术介绍
1、l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)，化学式为c9h11no2，分子量为165.19，是α-氨基酸的一种，属于芳香族氨基酸。l-苯丙氨酸是人体和动物不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，广泛应用于食品、医药、饲料等领域。在食品领域，苯丙氨酸可作为营养强化剂及饮料添加剂，可以合成优良甜味剂阿斯巴甜；在医药领域，主要用于氨基酸输液、综合氨基酸制剂及营养强化剂，在抗癌，降血压，消除肾与膀胱的功能性疲劳等方面有着巨大的作用；在饲料领域，作为饲用氨基酸，在水产动物饲料中补充苯丙氨酸有助于减少应激引起的骨骼畸形和死亡率，提高水产动物肠道消化酶活性。
2、目前，l-苯丙氨酸的工业生产方法分为直接提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高、可大规模生产等优点。因此目前世界上l-苯丙氨酸的工业化生产大多采用微生物发酵法。因为大肠杆菌代谢途径明确，具有快速生长和高细胞密度等优势，成为l-苯丙氨酸发酵的常用菌株。大肠杆菌中l-苯丙氨酸的生物合成路径为：以葡萄糖为底物，经过糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(pep)和戊糖磷酸糖磷酸途径的中间产物赤藓糖-4-磷酸(e4p)进行缩合，形成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)，然后经过莽草酸途径将dahp转化为莽草酸(shik)，之后再转化为分支酸(cha)，分支酸在分支酸变位酶作用下，转变为预苯酸，经脱水、脱羧后形成苯丙酮酸，后者在转氨酶作
3、但在大肠杆菌发酵产l-苯丙氨酸的过程中，常存在菌体浓度达到最大值后持续降低的现象。这是由于高浓度的l-苯丙氨酸会抑制菌体的生长，使菌体浓度持续下降，继而限制产量的提升。同时，由于l-苯丙氨酸路径的代谢通量不足，使大肠杆菌利用葡萄糖发酵产生l-苯丙氨酸的产量进一步受到限制。因此，提高大肠杆菌对于高浓度l-苯丙氨酸的耐受性，合理增加苯丙氨酸的代谢通量可以协同应用于提升l-苯丙氨酸的产量。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种增加菌株对高浓度l-苯丙氨酸耐受性的方法，所述方法既提升了所述构建方法的步骤为：(1)转录组学分析菌株在l-苯丙氨酸胁迫下各基因的表达情况；(2)筛选耐受靶点；(3)重组质粒pem-mara的构建。
2、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为在菌株中过表达dna结合转录相关因子。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述dna结合转录因子包括dna结合转录双调节因子基因mara、dna结合转录激活因子基因mhpr或dna结合转录抑制因子基因marr。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因mara的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因mhpr的核苷酸序列如seq id no.9所示。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因marr的核苷酸序列如seq id no.10所示。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
8、本专利技术还提供了一株生产l-苯丙氨酸的重组菌株，所述重组菌株耐受高浓度l-苯丙氨酸，所述重组菌株过表达dna结合转录双调节因子基因mara。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株过表达3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroa，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因arod，酪氨酸转氨酶基因tyrb，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因arof，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheafbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddg。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因aroa的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因arod的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因tyrb的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因arof的核苷酸序列如seq id no.5所示。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因pheafbr的核苷酸序列如seq id no.6所示。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因yddg的核苷酸序列如seq id no.7所示。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用pem质粒携带基因mara，基因aroa，基因arod和基因tyrb。
17、在本专利技术的一种实施方式中，利用携带有基因arof，基因pheafbr的质粒pacyc177-ci-arof-pheafbr表达基因yddg。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述pem质粒的核苷酸序列如seq id no.8所示，公开于文献hu,g.,li,z.,ma,d.et al.light-driven co2 sequestration in escherichiacoli to achieve theoretical yield ofchemicals.nat catal4,395–406(2021).
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述pacyc177-ci-arof-pheafbr公开于公开号为cn116656581a的中国专利申请文件中。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括菌株e.coli jnypq。
22、本专利技术还提供一种改造l-苯丙氨酸生产菌株的方法，所述方法提高苯丙氨酸的产量，所述方法为在l-苯丙氨酸生产菌株中过表达dna结合转录双调节因子基因mara。
23、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将质粒pem-mara-aroa-arod-tyrb和质粒pacyc177-ci-arof-pheafbr-yddg转化至l-苯丙氨酸生产菌株中。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述pem-mara-aroa-arod-tyrb质粒为以pem为载体，携带有基因mara，基因aroa，基因arod和基因tyrb。
25、在本专利技术的一种实施方式中，所述pacyc177-ci-arof-pheafbr-yddg质粒为以pacyc177-ci-arof-pheafbr为载体，携带有基因yddg。
26、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-苯丙氨酸生产菌株包括菌株e.coli jnypq。
27、本专利技术还提供一种生产l-苯丙氨酸的方法，将所述重组菌株加入发酵体系中进行发酵。
28、在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将所述重组菌株接种到种子培养基中培养，然后再转接到发酵培养基中继续发酵培养得到含有l-苯丙氨酸的发酵液。
29、在本专利技术的一种实施方式中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种增加菌株对高浓度L-苯丙氨酸耐受性的方法，其特征在于，所述方法为在菌株中过表达DNA结合转录因子；所述DNA结合转录因子包括DNA结合转录双调节因子基因marA、DNA结合转录激活因子基因mhpR和DNA结合转录抑制因子基因marR。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
3.一株生产L-苯丙氨酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株耐受高浓度L-苯丙氨酸，所述重组菌株过表达DNA结合转录双调节因子基因marA。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株过表达3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因aroA，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD，酪氨酸转氨酶基因tyrB，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroF，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheAfbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddG。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用pEM质粒携带基因marA，基因aroA，基因aroD和基因tyrB。
6.根据权利要求4或5所述的重组菌株，其特
7.根据权利要求3～6任一所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
8.一种改造L-苯丙氨酸生产菌株的方法，其特征在于，所述方法提高L-苯丙氨酸的产量，所述方法为在L-苯丙氨酸生产菌株中过表达DNA结合转录双调节因子基因marA；可选的，所述方法为在L-苯丙氨酸生产菌株中过表达3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD，酪氨酸转氨酶基因tyrB，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroF，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheAfbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddG。
9.一种生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，将权利要求3～7任一所述重组菌株加入发酵体系中进行发酵。
10.权利要求3～7任一所述重组菌株或权利要求8所述方法在生产L-苯丙氨酸或含有L-苯丙氨酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种增加菌株对高浓度l-苯丙氨酸耐受性的方法，其特征在于，所述方法为在菌株中过表达dna结合转录因子；所述dna结合转录因子包括dna结合转录双调节因子基因mara、dna结合转录激活因子基因mhpr和dna结合转录抑制因子基因marr。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株以大肠杆菌为宿主细胞。
3.一株生产l-苯丙氨酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株耐受高浓度l-苯丙氨酸，所述重组菌株过表达dna结合转录双调节因子基因mara。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株过表达3-磷酸莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因aroa，3-脱氢奎尼酸脱水酶基因arod，酪氨酸转氨酶基因tyrb，3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因arof，分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheafbr，芳香族氨基酸外排蛋白基因yddg。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用pem质粒携带基因mara，基因aroa，基因arod和基因tyrb。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈修来，王晓歌，刘立明，黄文潇，刘佳，高聪，李晓敏，吴静，胡贵鹏，宋伟，魏婉清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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