一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体涉及一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒的制备及应用，可以应用于宫颈癌筛查流程的风险分层，试剂盒检测包含与宫颈癌发生发展相关的18种高、中危型别，其中根据不同型别的风险等级可以对HPV16、18、31、33、52、58进行分型和定量分析，对除了以上6种型别以外的其它型别进行定量分析，最终通过配套分析软件对检测结果进行综合风险评分，用于风险分层。用于风险分层。用于风险分层。

【技术实现步骤摘要】
一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒及其检测方法

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[0001]本专利技术属于核酸检测
，特别涉及一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，及其检测方法。

技术介绍
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[0002]子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是目前唯一一个病因明确的恶性肿瘤。根据世界卫生组织统计，在全球范围内，2018年估计有57万例新病例，占所有女性癌症死亡人数的7.5％。在每年估计超过31.1万例死于宫颈癌的死亡中，其中超过85％发生在欠发达地区。在发达国家，已经实施了一些方案，女性可以接受针对人乳头瘤病毒的疫苗接种，并可以对妇女进行定期筛查。筛查可以在易于治疗的阶段识别出癌前病变。在这些国家，早期治疗可预防多达80 ％的宫颈癌。
[0003]人乳头瘤病毒(HPV)是一种主要存在于人皮肤、黏膜及女性宫颈上皮细胞异形区的微小共价双链环状DNA病毒，至今发现的HPV约有200多种，为一组形态和基因结构相似，但致瘤表现不同的病毒，可引起人类上皮的良性和恶性肿瘤。1995年国际癌症研究机构(IARC)正式宣布HPV某些型别持续性感染是导致宫颈癌的最主要因素。WHO把与宫颈癌发生有关的HPV型别称为高危型，与肿瘤不相关的称为低危型，最常见的低危型为HPV 6,11和81。依据IARC及其它研究成果，包括国家食品药品监督管理局HPV相关指导原则建议与宫颈癌相关的型别中HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68列为高危型别，HPV26，53，66，73，82列为中等风险型别。
[0004]研究提示在宫颈癌的发生中16、18、31、33等高危型的致癌性远远高于其他型别。70％以上的宫颈癌患者体内均发现感染HPV16或18型，不同型别的致癌性有所差异，如：HPV16见于50％的宫颈癌(多为鳞癌)；HPV18见于15％的宫颈癌(多为腺癌和神经内分泌癌)。美国阴道镜和宫颈病理学会将16和18型阳性列为病理学检测指症。HPV病毒载量，作为与感染细胞数和病毒数两者相关的参数，主要受两大因素的影响：HPV在宫颈表面感染程度和感染区域病毒量水平。病毒载量被认为是中度宫颈上皮内瘤变(CINⅡ)或更高级别的宫颈上皮内瘤变的潜在生物指征。尤其是病毒载量的持续监测而非单次测量是宫颈癌的发生发展的有效标志之一。
[0005]HPV感染是宫颈癌的直接病因。就大多数患者而言，从感染到最终宫颈癌的发生存在一个缓慢的潜伏期。为此，及时定期检测宫颈脱落细胞中HPV的有无及载量的变化在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。
[0006]鉴于此，本专利技术提出了一种基于荧光定量PCR法的快速分型定量检测18种高、中危型别的试剂盒，能够实现双管内同时检测18种HPV型别，并能够满足较高的灵敏度，对其中风险级别高的型别进行分型和定量分析，在通过配套软件对检测结果进行综合风险评分，具有明确的临床意义及潜在的应用价值。
[0007]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路
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[0008]本专利技术的目的在于提供一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，可以应用于宫颈癌筛查流程的风险分层，试剂盒检测包含与宫颈癌发生发展相关的18种高、中危型别，其中根据不同型别的风险等级可以对HPV6、18、31、33、52、58进行分型和定量分析，对除了以上6种型别以外的其它型别进行定量分析，最终通过配套分析软件对检测结果进行综合风险评分，用于风险分层。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，用于HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58进行分型和定量分析、以及除以上6种型别以外其他型仅进行定量分析，其特征在于：包括：核酸扩增反应液、HPV
‑
a组反应液、HPV
‑
b组反应液、阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；
[0010]核酸扩增反应液主要由2
×
PCR缓冲液、终浓度2～4mMMgCl2、0.05
‑
0.5mMdNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)、1～2UDNA聚合酶、0.05～0.1UUNG酶及去RNA酶水组成；
[0011]HPV
‑
a组反应液和HPV
‑
b组反应液包括了如SEQIDNo.1至SEQIDNo.34的引物探针；
[0012]所述阳性对照和弱阳性对照主要组分为不同浓度的人工合成的基因、C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mMTris(PH7.4)、1mMEDTA、5mg/ml海藻糖；
[0013]所述阴性对照主要组分为C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mMTris(PH7.4)、1mMEDTA、5mg/ml海藻糖。
[0014]该试剂盒反应体系的灵敏度确定为200copies/mL，其感染单位的绝对偏差不超过
±
0.5个对数数量级。
[0015]该试剂盒能够进行18种高/中危型的定型检测，涵盖了宫颈癌发生发展相关的最常见型别，根据大量筛查临床试验数据优选致癌性最高的7种型别进行分型和定量分析，对剩余型别进行定性和综合定量分析；分析灵敏度均高于以上对比文献，序列进行了优先，体系进行大量优化工作；配套用系统分析软件，对上述结果进行综合评分，获得进一步风险预警。
[0016]优选地，上述技术方案中，探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5或CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和MGB中的任意一种或几种。
[0017]一种利用前文描述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，采用实时荧光PCR技术和水解探针技术，主要以人乳头瘤病毒基因组L1、E7等区为靶区域，设计监测18个型别的引物和探针，其中包含型别特异性引物探针和通用型引物探针，分别以FAM、VIC/HEX、ROX、CY5等基团标记相应探针，在同一反应体系中可一次性定性检测18种型别人乳头瘤病毒及采集样本的细胞数，样本中宫颈脱落细胞数的获取通过参考基因与待测细胞的线性关系获得。
[0018]优选地，上述技术方案中，根据权利要求3所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，其特征在于：将配制的PCR反应液加好检测模板后放置于荧光定量PCR仪器中进行检测，实验检测程序具体为：UNG酶处理50℃5min；95℃10min预变性；变性、退火、延伸及检测荧光条件为：95℃10s，58℃30～40s，45cycles，58℃时荧光检测，反应体系配
置方法为：10～20μL 核酸扩增反应液，10～20μL引物探针反应液，5～20μL待测样本核酸。。
[0019]优选地，上述技术方案中，基于不同型别致癌性的差异，其病毒载量的权重也本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，用于HPV16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 52、HPV 58进行分型和定量分析、以及除以上6种型别以外其他型仅进行定量分析，其特征在于：包括：核酸扩增反应液、HPV
‑
a组反应液、HPV
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b组反应液、阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；核酸扩增反应液主要由2
×
PCR缓冲液、终浓度2～4mM MgCl2、0.05
‑
0.5mM dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)、1～2U DNA聚合酶、0.05～0.1U UNG酶及去RNA酶水组成；HPV
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a组反应液和HPV
‑
b组反应液包括了如SEQ ID No.1至SEQ ID No.34的引物探针；所述阳性对照和弱阳性对照主要组分为不同浓度的人工合成的基因、C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mM Tris(PH7.4)、1mM EDTA、5mg/ml海藻糖；所述阴性对照主要组分为C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mM Tris(PH7.4)、1mM EDTA、5mg/ml海藻糖；试剂盒反应体系的灵敏度确定为200copies/mL，其感染单位的绝对偏差不超过
±
0.5个对数数量级。2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，其特征在于：探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5或CY5中的任意一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蓉，吴惟茜，郭玉婉，彭莉，杨迎花，陈明，陈永红，赵西浩，王河清，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：