【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒。
技术介绍
1、疟疾是人体感染疟原虫所致的蚊媒传播性传染病，主要流行于热带和亚热带地区，典型的临床表现为周期性寒战、发热、大汗等症状，伴有肝脾肿大和贫血等体征。在传播媒介长期存在的情况下，因输入病例造成本地再度流行的风险依然存在。因此输入性疟疾的防治依然是疾病预防控制的重点工作。
2、寄生于人体的疟原虫主要有4种，即恶性疟原虫（plasmodium falciparum，pf）、间日疟原虫（plasmodium vivax，pv）、三日疟原虫（plasmodium malariae，pm）和卵形疟原虫（plasmodium ovale，po）。不同虫种引起的疾病严重程度和临床症状不统一。其中恶性疟最为严重，若不及时治疗，将会发展成重症疟疾，造成病例死亡；间日疟和卵形疟则常有复发。对不同疟原虫的治疗也有所差异，对恶性疟的治疗，轻症采取以青蒿素类衍生物为基础的复方或联用口服药物进行治疗，重症用蒿甲醚、青蒿琥酯、磷酸咯萘啶等注射治疗；对间日疟的治疗采用磷酸氯喹和伯氨喹组合的8日疗法，其中磷酸氯喹可用青蒿素类衍生物口服制剂替代。
3、目前鉴别疟原虫的方法学有厚薄血膜染色显微镜检查和荧光pcr方法。传统的显微镜检测特异性高，能区分虫种且分辨疟原虫发育阶段，但密度低时易漏检，在制备血涂片和镜检时需要经验丰富的技术员，整个过程费时费力；荧光pcr虽然灵敏度高，可做多重测试区分虫种，但需要专业技术人员进行操作，同时需要配备专业的pcr实验室和昂贵的实时
4、市场上常用的疟疾快速诊断采用免疫胶体金技术，虽简便易操作，适用性广，但检测靶标为疟原虫的富组氨酸蛋白-2（hrp2）或者乳酸脱氢酶（pldh），无法实现虫种区分，采用抗原抗体免疫结合反应原理，其灵敏度和特异性要低于核酸检测方法，亦无法满足疟原虫虫种的准确快速分型检测。
5、因此，开发一种能区分不同疟原虫虫种、且具有较高灵敏度和特异性的核酸快速检测产品，将有助于提高基层医疗机构对输入性疟疾病例诊疗的精准性及高效性，对输入性疟疾本地再传播的防控有重大意义。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒。基于lamp技术和免疫层析技术相结合、提供一种能快速鉴别恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟4种疟原虫的方法及试剂盒。
2、本专利技术融合lamp技术以及胶体金免疫层析技术，将检测4种疟原虫特异性核酸序列转换成检测标记在特异性引物上的荧光素，从而实现高灵敏度的可视化疟原虫鉴别分型，使得该检测试剂具有核酸pcr灵敏度和特异性的同时，亦可解决场地和专业技术受限的问题。同时在设计lamp引物时，采用6条引物组合，即外侧引物f3/b3、内侧引物fip/bip、环引物loopf/loopb，其中以loopf为特异性识别引物，增加检测灵敏度和特异性。
3、本专利技术提供的技术方案具体如下：
4、<第一方面>
5、一种用于区分疟原虫虫种的引物组合，所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫中的至少一种，所述引物组合包括：
6、疟原虫通用外侧引物：
7、f3: 5’-cggaaaccttgttacgac-3’，如seq id no.1所示；
8、b3: 5’-gcaattattaatcttgaacgagga-3’，如seq id no.2所示；
9、疟原虫通用内侧引物：
10、fip: 5’-ttgaaagatatgatgaattg-ttcctttaaaagataggatttac-3’，如seq id no.3所示；
11、bip: 5’- cggtaggagcgacgggc-gcctagtaagcatgattc-3’，如seq id no.4所示；
12、疟原虫通用下游环引物：
13、lb: 5’-aagggcagggacgtagtcagc-3’，如seq id no.5所示；
14、恶性疟原虫特异性上游环引物：
15、pf-lf: 5’-gaaaaattgaattatattcttttt-3’，如seq id no.6所示；
16、间日疟原虫特异性上游环引物：
17、pv-lf: 5’-gaagggggattatatctccttt-3’，如seq id no.7所示；
18、卵形疟原虫特异性上游环引物：
19、po-lf: 5’-ccagaaaaaagaaaatataattttcccttt-3’，如seq id no.8所示；
20、三日疟原虫特异性上游环引物：
21、pm-lf: 5’-aaaaagggtttttattcttttttc-3’，如seq id no.9所示。
22、所述lb的5’端使用生物素标记修饰。
23、所述pf-lf的5’端、pv-lf的5’端、po-lf的5’端、pm-lf的5’端均使用荧光素标记物修饰；
24、其中，pf-lf的5’端的荧光素标记物、pv-lf的5’端荧光素标记物、po-lf的5’端荧光素标记物、pm-lf的5’端荧光素标记物之间均不同；
25、所述荧光素标记物选自fitc、cy3、cy5、地高辛中的其中一种。
26、优选的、所述lb的5’端使用生物素标记修饰；pf-lf的5’端使用fitc标记修饰；pv-lf的5’端使用cy3标记修饰；po-lf的5’端使用cy5标记修饰；pm-lf的5’端使用地高辛标记修饰。
27、<第二方面>
28、一种用于区分疟原虫种的反应体系，所述反应体系包括如上所述的引物组合。
29、所述反应体系还包括扩增反应液、硫酸镁、bst dna polymerase、dh2o、密封液。
30、扩增反应液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、1%triton x-100、dntps。
31、所述引物组合中，f3的浓度为4~20µmol/l、b3的浓度为4~20µmol/l、fip的浓度为1~5µmol/l、bip的浓度为1~5µmol/l、lb的浓度为2~10µmol本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于区分疟原虫虫种的引物组合，所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫中的至少一种，其特征在于，所述引物组合包括
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述LB的5’端使用生物素标记修饰；所述pf-LF的5’端、pv-LF的5’端、po-LF的5’端、pm-LF的5’端均使用荧光素标记物修饰；
3.一种用于区分疟原虫种的反应体系，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合。
4.一种用于区分疟原虫种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3所述的反应体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试纸条；所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特
7.一种非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、NC膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于NC膜的一端，吸水纸的一端覆盖于NC膜的另一端；所述NC膜上设置有检测线T线和质控线C线。
9.根据权利要求8所述的非疾病诊断的区分疟原虫虫种的方法，其特征在于，所述样品垫的制备方法包括如下步骤：将基材在样本垫处理液中浸泡20-30min，干燥制得所述样品垫；
...【技术特征摘要】
1.一种用于区分疟原虫虫种的引物组合，所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫中的至少一种，其特征在于，所述引物组合包括
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述lb的5’端使用生物素标记修饰；所述pf-lf的5’端、pv-lf的5’端、po-lf的5’端、pm-lf的5’端均使用荧光素标记物修饰；
3.一种用于区分疟原虫种的反应体系，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合。
4.一种用于区分疟原虫种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3所述的反应体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试纸条；所述试纸条包括底板；底板上由一端至另一端依次设置有样品垫、金结合垫、nc膜、吸水纸；所述金结合垫包括主体部分和延伸部分，金结合垫的延伸部分位于样品垫和底板之间，金结合垫的主体部分远离样品垫的一端覆盖于nc膜的一端，吸水纸的一端覆盖于nc膜的另一端；所述nc膜上设置有检测线t线和质控线c线。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮卫，贾倩倩，李伟伟，杨标，金巍，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。