基于焦磷酸测序法的Septin9基因甲基化检测的引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测Septin9基因CpG岛的CG甲基化的引物、方法和试剂盒，所述引物包括从样本核酸中扩增Septin9基因CpG岛上与肠癌有关的5个CG位点的DNA片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物。通过本发明专利技术的引物、方法和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，可检测出与大肠癌易感肿瘤相关的Septin9基因甲基化的频率，从而筛查出早期大肠癌易感人群，特异性好，准确度高，而且能高通量检测样本。

Primers and Kits for Methylation Detection of Septin 9 Gene Based on Pyrophosphate Sequencing

The present invention discloses primers, methods and kits for detecting CG methylation on CpG island of Septin 9 gene. The primers include specific primers for amplifying DNA fragments of five CG sites related to intestinal cancer on CpG island of Septin 9 gene from sample nucleic acid and primers for pyrophosphatic acid sequencing of obtained nucleic acid fragments. By using the primers, methods and kits of the present invention and pyrophosphatic acid sequencing technology, the frequency of methylation of Septin9 gene associated with susceptible tumors of colorectal cancer can be detected, thereby screening susceptible populations of early colorectal cancer with good specificity, high accuracy and high throughput detection samples.

【技术实现步骤摘要】
基于焦磷酸测序法的Septin9基因甲基化检测的引物和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及用于Septin9基因甲基化位点检测的方法、引物和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，能对Septin9基因甲基化频率进行检测，特异性好，准确度高，而且可以进行高通量筛查甲基化样本。
技术介绍
Septin9基因位于染色体17q25.3，septin家族是一组高度保守的GTP结合蛋白，广泛存在于人类细胞，在细胞分裂中提供结构支撑。在人体当中，总共有13个Septin基因，相应编码15种多肽。所有Septin可以形成异聚复合物并参与高级结构的组成，在肌动蛋白动力学、血管生成、细胞生成、细胞运动、细胞增殖、细胞形状、细胞质分裂、微管调节，囊泡靶向与胞吐作用方面均有重要的生理作用。目前认为，septins形成稳定的六聚体或八聚体，六聚体包含2分子Septin2、Septin6和Septin7，而八聚体包含两分子Septin9。研究表明，Septin9占据了八聚体终端的位置，对亚基聚合起关键作用，并稳定整个多聚体，在子细胞的胞质分裂过程的最后阶段至关重要。Septin9在Septin多聚体中的关键作用可能是Septin9超甲基化及转录受到抑制时引起癌变的关键因素。研究表明，Septin9与多种癌症发生有明显关系，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、头颈部癌症、白血病和淋巴瘤。然而结直肠癌中Septin9基因异常甲基化的检出率要远高于其它癌症，Grutzmann等对Septin9基因在各种肿瘤及非肿瘤疾病患者血浆的甲基化水平进行了系统研究，结果显示，结直肠癌患者血浆Septin9甲基化的检出率(72％，90/125)远高于非结直肠癌的其他癌症患者(11.5％，11/96)、非癌症疾病患者(13％，41/315)及正常人(10％，19/183)。这一结果说明血浆中Septin9甲基化对结直肠癌有较高的灵敏度和特异性，与其他癌症、非癌症疾病和正常人有显著性的差异。Septin9_V2转录本的启动子区域DNA甲基化是CRC癌变的标志，随着疾病从腺瘤进展到不典型增生再到癌，组织中Septin9mRNA的表达进行性减少，CRC组织中Septin9的表达量显著低于健康组。而研究表明，在结肠腺瘤和癌组织中，Septin9_V2转录本的甲基化模式的重大变化只限于一个CpG岛，即CGI3。在Septin9CGI3核心区，这种独特的甲基化模式可能代表甲基化状态的过渡，并在细胞水平反应结肠粘膜中恶性肿瘤的进展。CGI3的超甲基化可以抑制Septin9_V2的正常表达，进而扰乱结构蛋白的形成和关键细胞功能。目前检测甲基化的方法主要有甲基化特异性PCR(MS-PCR)，亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)，荧光定量法(Methylight)等等。PCR方法虽然无需特殊仪器，经济实用，是目前简单便宜得一种检测方法，但灵敏度不够，而且预先需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计非常重要。另外，亚硫酸氢盐处理也十分关键，若处理不完全则可能导致假阳性的出现。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多，操作繁琐，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定量的技术方法。甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现。使用该方法进行甲基化分析仅需一对引物，相对简单，不过这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在进行实时定量PCR过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，筛选出感兴趣的CPG位点，然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。这种方法最大的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。荧光定量法(Methylight)这种技术是在MSP技术上发展起来的，在MSP扩增过程中利用荧光染料进行定量。探针法的应用使得该技术具有更高的精确性。方法最大的优势在于其高敏感性和较高通量，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。但是探针订购费用较高，适用于少数位点大量样本筛选。而本研究采用焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术，充分屏蔽了上述方法的缺陷，即可以高通量筛查，又可以同时检测多个甲基化位点，现在认为焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是甲基化检测新的金标准。焦磷酸测序作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出精确的甲基化程度的数据。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术除了利用特异性的引物对Septin9基因CpG岛DNA片段进行常规PCR扩增外，还利用焦磷酸测序引物对PCR扩增片段进行反向测序，不仅能够检测具体甲基化改变情况，也能同时得到每个CG基因的甲基化频率，使检测结果更加具体化，从而能够更好地为肿瘤个体化治疗提供有益的指导。在进行焦磷酸测序过程中，四种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入测序反应体系中。在每一轮测序反应中，只加入其中一种。如被加入的dNTP与DNA模板配对，DNA聚合酶可以催化该dNTP与焦磷酸测序引物SFRP2-S的3'端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)就被释放出来。加入的dNTP和释放出来的PPi的摩尔数是相等的。接着，ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)催化过硫酸铵(ammoniumpersulfate,APS)和PPi形成ATP，此ATP和PPi的摩尔数也是一致的。利用ATP作为能源，荧光素酶(luciferase)可将荧光素氧化为氧化荧光素(oxyluciferin)，进而发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测，并由程序pyrogramTM转为波形讯号。每个波峰的高度(光信号)与反应中加入的核苷酸数目成正比。基于这种焦磷酸测序技术，本专利技术提供用于检测Septin9基因CpG岛甲基化的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其特征在于，从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物碱基序列为：Septi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测Septin9基因CpG岛甲基化的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其特征在于，从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物碱基序列为：Septin9‑F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAGSeptin9‑R:Biotin‑TCCRAAATAATCCCATCCAAC对所获得的核酸扩增产物进行焦磷酸测序的引物碱基序列为：Septin9‑S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG。

【技术特征摘要】
1.用于检测Septin9基因CpG岛甲基化的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其特征在于，从样本核酸中扩增Septin9基因片段的特异性引物碱基序列为：Septin9-F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAGSeptin9-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC对所获得的核酸扩增产物进行焦磷酸测序的引物碱基序列为：Septin9-S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物Septin9-R的5'端被生物素标记。3.一种用于检测Septin9基因CpG岛甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用引物Septin9-F和Septin9-R扩增Septin9基因片段，获得PCR扩增产物；引物序列如下：Septin9-F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAGSeptin9-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC；(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功；(5)若步骤(4)中扩增成功，则进行单链纯化；(6)利用焦磷酸测序引物对步骤(5)中的单链纯化产物进行测序；焦磷酸测序引物序列如下：Septin9-S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG；(7)根据步骤(6)中的焦磷酸测序结果，得到每个CG位点的甲基化频率。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)扩增的反应条件为94℃2分钟；98℃10秒，60℃20秒，68℃20秒，35个循环；68℃5分钟。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(5)单链纯化的具体步骤为：将得到的50ulPCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，吴鹏飞，
申请(专利权)人：南昌艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36