一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医学核酸检测试剂盒技术领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒，包括PCR扩增引物、Taq‑man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照。所述的标记Taq‑man探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测，且价格低廉，操作简单。

A Kit for Detecting Exon 19 Deletion Mutation of EGFR Gene and Its Preparation and Application

The invention relates to the technical field of biomedical nucleic acid detection kit, in particular to a kit for detecting deletion mutation of exon 19 of EGFR gene of epidermal growth factor receptor, including PCR amplification primers, Taq man probes, digital PCR premix, micro-droplet oil generation, negative control and positive control. The labeled Taq_man probe and PCR amplification primers can be used to prepare kits, detect exon 19 deletion mutations of EGFR based on digital PCR platform, provide reference for targeted therapy and screening patients, and can also be used for high sensitivity early recurrence monitoring of cancer patients, especially lung cancer patients, and drug resistance mutation monitoring during drug use, with low cost and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学核酸检测试剂盒
，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因的特定位点突变已经成为指导靶向治疗用药的先决条件。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点，有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子，因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中90％的突变位于19和21区的外显子，称为经典型突变，外显子18和20突变约占10％。外显子19的突变主要是第746-750位密码子(ΔE746-E750)缺失突变，导致其相应的氨基酸序列丢失。外显子19缺失突变占约46％，主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变。因此EGFR外显子exon19缺失突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。目前基因变异的检测技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法。现分别简介于下：测序法是目前进行EGFR突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高；聚合酶链式反应－单链构象多态性分析(PCR-SSCP)PCR-SSCP是一种比较经典的基因突变检测的方法，该方法可以对未知的突变进行检测。与测序法相比，PCR-SSCP灵敏性更高，操作简单，无需特殊仪器，还可以对未知的突变进行检测；ARMS法也称扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)、等位基因特性PCR(AlleleSpecificPCR，ASPCR)等，即等位基因特异性扩增法(AlleleSpecificAmplification，ASA，选择性地扩增野生型或突变型基因。上述现有技术存在以下问题：价格昂贵，操作复杂，且一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。
技术实现思路
针对现阶段检测EGFR基因外显子19缺失突变的方法中存在的问题，本专利技术提供了一种价格低廉，操作简单，可一次性测定八种突变的检测试剂盒及其方法，为个体化用药提供参考。本专利技术技术方案如下：一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，包括PCR扩增引物、Taq-man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照。所述的PCR扩增引物，包括反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；用于扩增含有EGFR外显子19上c.2204-c.2335序列的片段；所述的EGFR外显子19上c.2204-c.2335的序列如SEQNo.1所示；所述的Taq-man探针包括位点探针及参考探针；所述的参考探针序列如SEQNo.2所示:所述的位点探针序列如SEQNo.3所示；所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。所述的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；所述的猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。优选地，所述的反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物包括上游引物及下游引物；所述的上游引物的序列如SEQNo.4所示：所述的下游引物的序列如SEQNo.5所示：所述的数字PCR预混液包括TaqMan聚合酶、dNTP、MgCl2、PCRbuffer、PCR反应增强剂、稳定剂。所述的上游引物和下游引物的使用浓度为5μM～15μM，在最终反应体系中的浓度为400nM～1200nM。优选地，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为800nM。所述的位点探针和参考探针的使用浓度为5μM～25μM，在最终反应体系中的浓度为100nM～500nM。优选的所述的位点探针和参考探针的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为200nM。所述的阴性对照来源于携带EGFR基因19外显子野生型非小细胞肺癌细胞A549。所述的阳性对照来源于携带EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9。上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)DNA提取：提取含有EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9和EGFR基因野生型细胞A549的基因组DNA；(2)数字PCR反应液制备；(3)PCR反应微滴制备；(4)PCR扩增：退火后，然后扩增反应；(5)检测及计算突变率。所述步骤(2)包括：将待检测样品、PCR扩增上下游引物、EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针以及数字PCR预混液混合，无酶水补足加样体系，制备得到数字PCR混合液。所述步骤(3)包括：将PCR反应液转移至微滴发生卡，在油孔中加入微滴生成油，制备微滴。所述的扩增反应过程为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，55℃～63℃退火/延伸60～120秒，，共进行20～60个循环，95℃～100℃酶失活8～16分钟，16℃无限循环。优选地，所述的扩增反应过程为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60.1℃退火/延伸120秒，共进行40个循环，98℃酶失活10分钟，16℃无限循环。上述的标记Taq-man探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。本专利技术以美国伯乐微滴式数字PCR为平台，选择EGFR基因19外显子区域进行探针和引物的设计。所选择的潜在19外显子缺失突变的位点为EGFR基因19外显子E746-P753位点缺失突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增引物、Taq‑man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照；所述的PCR扩增引物，包括反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；用于扩增含有EGFR外显子19上c.2204‑c.2335序列的片段；所述的EGFR外显子19上c.2204‑c.2335的序列如SEQ No.1所示；所述的Taq‑man探针包括位点探针及参考探针；所述的参考探针序列如SEQ No.2所示；所述的位点探针序列如SEQ No.3所示；所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增引物、Taq-man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照；所述的PCR扩增引物，包括反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；用于扩增含有EGFR外显子19上c.2204-c.2335序列的片段；所述的EGFR外显子19上c.2204-c.2335的序列如SEQNo.1所示；所述的Taq-man探针包括位点探针及参考探针；所述的参考探针序列如SEQNo.2所示；所述的位点探针序列如SEQNo.3所示；所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；所述的猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物包括上游引物及下游引物，所述的上游引物序列如SEQNo.4所示：所述的下游引物序列如SEQNo.5所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的数字PCR预混液包括TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCRbuffer、PCR反应增强剂、稳定剂。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为5μM~15μM...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋兴国，宋现让，谢丽，
申请(专利权)人：宋兴国，
类型：发明
国别省市：山东,37