一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒技术方案

本发明专利技术公开了一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、基因敲除系统及试剂盒，本发明专利技术筛选出切割效率高的靶位点以及设计、制备出特异靶向目标基因的gRNA，通过CRISPR‑Cas9技术有效敲除CXCR4基因，以及通过CRISPR‑nickase基因编辑技术，敲除细胞表面的HIV病毒辅助受体CXCR4，在有效进行CXCR4基因敲除的前提下大大减少脱靶效率，提高临床使用的可行性，降低安全风险。

A gRNA, expression vector, knockout system, kit for the knockout of the CXCR4 gene

The invention discloses a method for gRNA gene knock, in addition to the CXCR4 gene knockout system and kit of the invention, screened by gRNA specific target gene with high cutting efficiency and the design target, system, through the CRISPR effective Cas9 CXCR4 gene knockout, and through the CRISPR nickase gene editing, deletion of HIV virus coreceptor CXCR4 cell surface, greatly reduce the Miss efficiency in the effective CXCR4 gene knockout of the premise, to improve the feasibility of clinical use, reduce security risks.

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒
本专利技术涉及用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、基因编辑系统、试剂盒及它们的相关用途，属于基因工程领域。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。HIV以人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。HIV在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多HIV感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于HIV的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。对于HIV感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低HIV相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviraltherapy，ART)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制HIV在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。全球首例HIV感染的治愈发生在“柏林病人”身上，他接受了一名CCR5-Δ32基因突变纯合体捐献者的骨髓移植，此后的五年都没有在其身上检测到HIV病毒的踪迹。HIV-1主要有R5-嗜性和X4-嗜性两种，对应的辅助受体分别为CCR5和CXCR4。R5-嗜性病毒在感染的前期起主导作用，但随着病程的发展，病毒逐渐突变成X4-嗜性，X4-嗜性的HIV病毒成为患者体内病毒的主流群体。随着基因编辑技术的兴起，多国科学家都尝试通过ZFN、TALENT、CRISPR-cas9等基因编辑技术，敲除HIV入侵和整合过程中的关键基因，从而干预病毒的转录、复制和扩散。通过基因编辑的方式敲除或抑制细胞(如CD4+T细胞、淋巴细胞、骨髓干细胞等)表面的HIV病毒辅助受体的表达，抑制病毒扩散从而延缓和治疗艾滋病，已经成为HIV基因治疗研究的常见思路。对HIV感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段：一，基于RNA的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shRNA、siRNA、反义RNA等；二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如ZFN(ZincFingerNuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNuclease)等。其中CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)-Cas(CRISPR-associatedendonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于ZFN和TALEN需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，CRISPR更简单，具有更广泛的适应性，应用前景更广泛。CRISPR是在细菌体内发现的一种抵抗外来病毒入侵的系统，科学家在多种细菌中均发现了CRISPR，但目前最常用，研究最成熟的是酿脓链球菌Streptococcuspyogenes的CRISPR系统(SpCRISPR-Cas9)。它由一段crRNA和tracrRNA的嵌合体(crRNA-tracrRNAchimera)和一个Ⅱ类CRISPR系统的非特异性的内切核酸酶9(Cas9)组成，其中的RNA嵌合体由一段Cas9绑定序列gRNAscaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的RNA向导序列(guideRNA，gRNA)构成。靶序列末端的PAM(5’-NGG-3’)序列(protospaceradjacentmotif)为Cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。因为酿脓链球菌Cas9的PAM序列只有三个核苷酸，gRNA识别的靶序列也只是20个核苷酸，虽然设计和使用起来简便，但是非特异结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶即RNA嵌合体和Cas9蛋白非特异的结合于除目的基因以外的基因组的其他位点，可能导致非预期的基因突变，对人体造成不可预估和不可控制的影响。脱靶效率对于基因治疗来说，是临床使用上的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。Nickase(缺口酶)是Cas9蛋白的D10A突变型，它保留了结合gRNA从而靶定目的基因的功能，但是不能产生双链断裂，只能在识别位点附近产生一个单链缺口。缺口酶配合一对gRNA(分别位于正义链和反义链)使用，可分别在相对的两条DNA链上产生切口，从而形成功能性的双链断裂(如图1)。随后细胞通过NHEJ机制修复基因并引入插入/缺失突变，达到基因敲除的目的。Nickase配合一对分别位于目的基因正义链和反义链的gRNA使用，将特异性识别的靶序列从一段20nt的核苷酸序列扩增到两段共40nt的核苷酸序列，同时两段靶序列的3’-端都要求有PAM序列。这种设计最大限度的降低了CRISPR技术的脱靶效应，大大减少了非预期的脱靶基因修饰。现有技术中有使用抗体、拮抗剂、受体化合物等来抑制CXCR4的功能，以期在一定程度上缓解HIV-1在PBMC中的扩散；使用ZFN或TALEN基因编辑技术敲除CXCR4基因，破坏它的功能，有望在艾滋病预防和治疗中应用。但是使用抗体、拮抗剂、受体化合物等不能从源头抑制CXCR4的功能，需要长期甚至终身用药，才能在一定程度上抑制病毒繁殖。因为CXCR4是细胞表面的膜蛋白，其编码和表达调控都是由基因组决定的，只有从基因组层面敲除CXCR4的基因，才能彻底破坏其功能。而用ZFN来敲除CXCR4，首先需要设计27nt的基因特异性修饰位点，还需要设计能够识别CXCR4基因的锌指核酸酶的氨基酸序列，并把这些序列插入到相应的锌指核酸酶编码筐当中，整个设计和使用繁琐复杂，使用成本高。现有技术中还有使用SpCRISPR-Cas9对CXCR4基因进行敲除的(专利号201410770508.X)。与现有技术相比，根据本专利技术提供的方案所筛选出来的gRNA，在同等条件下对CXCR4的突变效率更高。而本专利技术还使用CRISPR－nickase基因编辑系统来敲除CXCR4基因，降低脱靶风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能有效敲除CXCR4基因的CRISPR-Cas9基因编辑系统，在有效敲除CXCR4基因的同时使得设计和使用大大简化。另外，本专利技术还提供一种既能有效敲除CXCR4基因，又能将脱靶效率降到最低的CRISPR-nickase基因编辑系统，从而降低CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于敲除CXCR4基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:24中的一种所示。

【技术特征摘要】
2016.12.13 CN 201611148300X1.一种用于敲除CXCR4基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:24中的一种所示。2.一种用于敲除CXCR4基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求1所述的gRNA。3.一种用于敲除CXCR4基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，包括如权利要求1所述的gRNA和cas9蛋白。4.一种用于敲除CXCR4基因的试剂盒，其特征在于，包括表达cas9蛋白和如权利要求1所述的gRNA的载体。5.一种用于敲除CXCR4基因的gRNA组合物，所述gRNA组合物由靶序列如SEQIDNO:1所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:4所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:1所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:2所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:4所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:2所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:6所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:7所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:8所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:9所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:4所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:9所示的gRNA和靶序列如SEQIDNO:5所示的gRNA组成，或由靶序列如SEQIDNO:9所示的gRNA和靶序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁福才，祝海宝，罗思施，黄雨亭，陶米林，刘方方，唐忆琳，
申请(专利权)人：广东赤萌医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44