一种翻译水平基因表达调控的方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医学和分子生物学领域，具体涉及一种增强型基因表达调控元件进行翻译水平调控基因表达的方法。公开了一种增强型基因表达调控元件，包含所述强型基因表达调控元件的嵌合编码结构，真核蛋白表达高效表达的方法，包含增强型基因表达调控元件和所述核苷酸嵌合编码结构的遗传重组载体，病毒转染系统，及其在上调或激活转录后翻译水平调控基因表达和制备真核蛋白或治疗疾病的药物中的用途。本发明专利技术可用于解决转基因科研和应用中存在或可能存在的基因高转录，低表达问题，为基因的功能研究以及基因治疗提供更好的技术手段，进而促进基因工程产业和生物靶向治疗产业的发展。

A method and application of the regulation of translation level gene expression

The invention belongs to the field of biomedicine and molecular biology, and specifically relates to an enhanced gene expression regulatory element, which regulates gene expression at translational level. A type of gene expression regulatory elements, including the type of gene expression regulatory elements encoding chimeric structure, expression of eukaryotic protein expression methods, including enhanced gene expression genetic recombinant vector regulatory elements and the nucleotide encoding chimeric structure, virus transfection system, and activation of transcription in up or after translation regulation of gene expression and use of eukaryotic proteins or preparing drugs treatment of disease. The invention can be used to solve the existing or possible gene transcription in transgenic research and application, low expression, and provide better technical means for studying gene function and gene therapy, and promote the development of genetic engineering industry and biological targeted therapy industry.

【技术实现步骤摘要】
一种翻译水平基因表达调控的方法及应用
本专利技术属于生物医学和分子生物学领域，涉及一种基因表达调控方法，具体涉及一种增强型基因表达调控元件进行翻译水平基因表达调控的方法及应用。
技术介绍
当前，基因工程技术已经成为生产包括药用蛋白的多种人类所需的药物和活性物质和基因靶向治疗产品的重要方法。在基因工程生产
，基因表达水平是影响目标产物的收率的前期关键因素。高水平的基因表达是基因工程领域人员的重要目标。真核基因表达调控技术多年来已经成为在生物医学研究领域和基因工程领域的重要热门方向。当前基因工程领域的真核基因表达调控，最明显的特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的，有序的，不可逆的分化和发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常的生理功能。真核生物基因表达调控据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或叫可逆调控，相当于原核生物对环境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种代谢底物浓度或激素水平升降时及细胞周期在不同阶段中酶活性和浓度调节。第二类是发育调节或称不可逆调控，这是真核生物基因表达调控的精髓，因为它决定了真核生物细胞分化，生长，和发育的全过程。据基因调控在同一时间中发生的先后次序，又可将其分为转录水平调控，转录后的水平调控，翻译水平调控及蛋白质加工水平的调控。通常认为基因产物的表达程度是和基因转录的强度成正比，常用的基于慢病毒为载体的转基因表达调节系统方案，大都是通过调节转染基因的转录从而实现对基因表达产物的调节。现有技术对真核基因表达的调控方式主要是组织特异性启动子在不同的细胞中的活性差异，驱动目的基因在靶器官组织中的特异性表达。在相关研究中常常发现，尽管期望的转染基因使用系统的方案实现了成功高效的转录，但并不是所有的基因转录产物都可以高效的表达为作为最终功能执行者的蛋白质。其中有较大的概率出现转录后不翻译或者翻译效率极低的现象，形成限制真核生物基因工程和靶向生物治疗发展的瓶颈。。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强型基因表达调控元件，及其与目标基因的嵌合编码结构和该嵌合编码结构的构建方法，上述结构和方法在上调或激活转录后翻译水平调控基因表达中和在制备真核蛋白或治疗疾病的药物中的应用。具体涉及在目标产物基因起始密码子上游加入本专利技术提供的增强型基因表达调控元件，从而在翻译水平激活目标产物的方法，解决基因工程领域中目标产物转录后不翻译或翻译水平低下的缺陷。本专利技术是通过以下技术方案实现的:本专利技术的第一方面，提供了一种增强型基因表达调控元件。所述增强型基因表达调控元件可将目标基因转录后的翻译水平提高达10倍～20倍，所述增强型基因表达调控元件具有如SEQNo.1所示或与SEQNo.1所示序列同源性为65～99％的核苷酸序列。进一步地，本专利技术的增强型基因表达调控元件(以下简称SEQNo.1)是与目标产物核苷酸序列连接为嵌合体后，通过病毒转染等手段整合在宿主染色体DNA上，进而发挥激活翻译的功能。本专利技术的第二方面，提供了SEQNo.1与目标产物的核苷酸嵌合编码结构。其中所述核苷酸嵌合编码结构，包含5’到3’顺次连接的SEQNo.1和目标产物核苷酸编码序列。SEQNo.1是在所述目标产物核苷酸序列翻译起始密码子ATG的上游，SEQNo.1的3端与所述目标产物核苷酸翻译起始密码子之间间隔1～20个碱基，优选1～10个碱基，更优选1～5个碱基，最优选0个碱基。本专利技术的第三方面，提供了包含SEQNo.1的具有提高表达目标产物转录后翻译水平功能的核苷酸嵌合体的构建方法，包括步骤：(1)所述增强型基因表达调控元件SEQNo.1序列的设计与合成。(2)引物序列的设计与合成。所述引物序列包含5’引物和3’引物，设计与合成的引物见实施例1。5’引物包含载体的部分核苷酸序列(其含有限制性内切酶位点BamHI)，完整的SEQNo.1和目标产物编码基因的部分起始序列；3’引物包含目标产物编码基因的部分末端序列及载体的部分核苷酸序列(其含有限制性内切酶位点EcoRI)。SEQNo.1序列的设计与合成是与引物的设计与合成同时进行的。(3)利用DNA聚合酶链式反应，以目标基因的cDNA为模板采用上述合成的引物对，通过克隆PCR合成含有SEQNo.1的完整目标基因序列(嵌合体结构)。本专利技术的第四方面，提供了真核蛋白高效表达的方法包括步骤1.目标蛋白编码基因表达调控嵌合体的PCR扩增合成2.目标基因表达质粒构建3.能稳定高效诱导表达目标蛋白编码基因能力的哺乳动物细胞系的构建。4.目标蛋白编码基因的诱导表达。5.诱导表达量的检测在一些实施方式中，步骤2包括(1)重组慢病毒的制备、提纯及浓缩；(2)通过病毒感染和抗性筛选形成稳定表达反式激活因子rtTA-Advanced的哺乳动物细胞(3)通过病毒感染和puromycin抗性筛选形成稳定表达目标蛋白的哺乳动物细胞在一些实施方式中，目标蛋白编码基因为BRAFV600E基因。在一些实施方式中，哺乳动物细胞为黑色素瘤细胞。在一些实施方试中，抗性筛选标记为geneticin抗性。在一些实施方试中，抗性筛选标记为puromycin抗性。在一些实施方式中，步骤2构建表达质粒的起始质粒为PLVX-tight-Puro。本专利技术的第五方面，提供了包含第一方面所述的增强型基因表达调控元件和第二方面所述的核苷酸嵌合编码结构的遗传功能载体。在一些实施方式中，遗传功能载体为质粒。在一些实施方式中，作为遗传功能载体的质粒包括pLVX-Tet-OnAdvancedvector，pLVX-Tight-Puro，pMD2.G，psPAX2。本专利技术的第六方面，提供了第一方面所述的增强型基因表达调控元件在上调或激活转录后翻译水平调控目标蛋白编码基因表达中的用途。本专利技术的第七方面，提供了第一方面所述的增强型基因表达调控元件或第二方面所述的核苷酸嵌合编码结构、第五方面所述的遗传功能载体在制备真核蛋白或治疗疾病的药物中的应用。进一步地，所述疾病包括肿瘤、炎性疾病。进一步的，也可用于在蛋白质制剂生产中提高产量，特别是所生产蛋白质长时间持续表达对宿主细胞产生毒性时，此系统提供的瞬时高产能力可大大降低生产成本。本专利技术的有益效果：本专利技术可用于提高转基因表达蛋白质的效率和稳定性解决转基因科研和应用中存在或可能存在的基因高转录,低表达问题，为基因的功能研究以及基因治疗提供更好的技术手段，可以预期，一种即可有效提高目标基因转录产物的翻译水平，又可与诱导表达系统结合，使得在研究特定蛋白质在不同表达强度下的生物功能的技术成为可能进而可促进基因工程产业和生物靶向治疗产业的发展。附图说明图1.将目标基因插入PLVX-tight-puro质粒的模式图图2.双酶切的PLVX-tight-puro重组质粒胶电泳的凝胶紫外成像其中，泳道0为DNAMarker(1KbPlusDNALadder)(购自invitrogen)，泳道1和2为实施例PLVX-tight-puro重组质粒BamHI内切酶和EcoRI双酶切后所得片段。图3.本专利技术实施例1提到的PLVX-tight-Puro载体图图4.pMD2.G载体图谱(Addgene)图5.psPAX2载体图谱(Addgene)图6.本专利技术实施例3pLVX-Tet-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强型基因表达调控元件，其中，所述增强型基因表达调控元件可将目标真核产物基因的转录后翻译水平提高达10倍‑20倍，所述增强型基因表达调控元件具有如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列同源性为95～99％的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种增强型基因表达调控元件，其中，所述增强型基因表达调控元件可将目标真核产物基因的转录后翻译水平提高达10倍-20倍，所述增强型基因表达调控元件具有如SEQIDNO.1所示或与SEQIDNO.1所示序列同源性为95～99％的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的增强型基因表达调控元件，其中，所述增强型基因表达调控元件是与目标真核产物的核苷酸序列连接为嵌合体后，通过嵌合体遗传重组进入宿主而发挥激活翻译的功能。3.一种包含权利要求1或2任一项所述的增强型基因表达调控元件的嵌合编码结构，其中，所述嵌合编码结构包含权利要求1所述的增强型基因表达调控元件和目标真核产物的核苷酸编码序列的5’端到3’端顺次连接物，所述增强型基因表达调控元件的3’是连接在所述目标真核产物的核苷酸序列翻译起始密码子的上游1～20个碱基或优选1～10个碱基或优选1～5个碱基或优选0个碱基处。4.一种真核蛋白表达高效表达的方法，包括步骤：(1)构建包含权利要求3所述的核苷酸嵌合编码结构的重组表达载体；(2)将(1)所得重组表达载体通过遗传操作转到宿主中，高效构建真核目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：王骏，
申请(专利权)人：张宝会，
类型：发明
国别省市：陕西,61