一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法技术

本发明专利技术涉及一种逆境诱导型启动子序列，包含SEQ ID NO:1的1388bp的 DNA核苷酸序列，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术还提供了一种逆境诱导型启动子植物表达载体及使植物在低温、干旱和盐诱导下表达目标基因的方法，可将目标基因替换

An expression vector of adversity inducible promoter, adversity inducible promoter and expression of inducible target gene

The invention relates to a stress inducible promoter sequence, nucleotide sequence of DNA contains SEQ ID NO:1 1388bp, which belongs to the technical field of plant gene engineering. The invention also provides an adversity inducing promoter plant expression vector and a method for making plants express target genes under low temperature, drought and salt, which can replace target genes.

【技术实现步骤摘要】
一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子表达载体及诱导目标基因表达方法。
技术介绍
低温冷害、干旱和土壤盐渍化是限制农业生产、威胁粮食安全的重要灾害，尤其是春秋季节的寒潮和作物生长关键期的干旱能够导致农作物的大面积受损，造成严重的减产。因此，除了加强对低温、干旱和盐害的防御技术研究之外，通过植物基因工程技术手段，使抗逆基因在作物中进行表达，以提高作物对逆境胁迫的抗性，减少低温、干旱和高盐对作物造成的严重伤害，已成为农作物育种的一个重要手段。目前植物中的基因表达调控主要包含DNA水平调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控以及翻译后水平调控。启动子是位于转录起始位点前的一段DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使其与模板DNA准确结合，从而起始相关基因转录，并且启动子上有许多顺式作用元件，通过与反式作用因子相互作用，可以调控下游靶基因的表达，是转录水平调控中的关键步骤。研究发现植物启动子主要有组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。其中组成型启动子在植物的整个发育阶段均能稳定启动基因表达，不受外界环境诱导而发生剧烈变化；组织特异型启动子能够在特定的时期、特定的组织中启动基因的表达；诱导型启动子则能够根据不同的环境胁迫或激素刺激等诱导基因的表达，进而增强植物对不利环境条件的防御能力，保护植株的正常生理代谢和生长发育。目前在植物转基因研究中最常使用的是组成型启动子，常见的有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、水稻肌动蛋白Actin启动子和玉米泛素Ubiquitin启动子，其中CaMV35S启动子主要应用于双子叶植物的转基因研究中，Actin和Ubiquitin启动子多用于单子叶植物中，尤其是在水稻和玉米转基因研究中Ubiquitin启动子被广泛用于驱动外源基因表达。虽然组成型启动子在启动外源基因表达时具有稳定、高效和广谱等优点，但是由于在植物整个生长发育过程中高效、持续表达目标基因，容易造成蛋白的过量表达，不仅造成了能量上的浪费，同时也容易影响植物自身的生理平衡，进而可能影响到产量。因此，越来越多的研究者将研究重点转向了在特定条件下诱导表达的诱导型启动子和在特定部位、特定时期表达的组织特异型启动子，以缓解由异源蛋白的过量表达而对植物生长造成的伤害。目前已有许多关于植物组织特异型启动子的研究报道：例如在叶片中特异表达的拟南芥atslA基因和玉米C4PdK基因启动子；在果实中特异表达的E4、E8、ACC合酶基因启动子；在维管束中特异表达的菜豆PAL、GRP118基因启动子；在根中特异表达的拟南芥Pyk10基因启动子等。关于诱导型启动子的研究报道主要包含非生物逆境胁迫诱导型、生物胁迫诱导型、光诱导型和激素诱导型等。这种诱导型启动子在正常条件下不表达或者表达量很低，当相应诱导条件出现时开始大量表达相关蛋白，从而减少不良环境对植物造成的伤害。研究表明有些诱导型启动子可以同时受多种因素诱导，被称为多元诱导型启动子，例如：拟南芥Cor15a基因启动子具有低温和干旱诱导特性；拟南芥rd29A启动子具有低温、干旱和高盐诱导活性；水稻质膜CaATPase启动子具有干旱、冷、MeJA和ABA诱导特性。利用诱导性启动子在特定条件下驱动抗逆基因的高效表达，增强植物对不良环境条件的抗性，近年来逐渐成为了研究的热点。然而能够广泛应用于转基因研究的诱导型启动子目前仍然比较少，特别是多元诱导型启动子。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题（一）是：提出一种能够在低温、干旱和盐胁迫下诱导外源基因表达的逆境诱导型启动子序列。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种逆境诱导型启动子，所述逆境诱导型启动子包含SEQIDNO:1的1388bp的DNA核苷酸序列。进一步的，所述逆境诱导型启动子的序列来自二穗短柄草AP2/EREBP家族基因BdDREB-47。本专利技术要解决的技术问题（二）是：提出一种能够应用于遗传转化的植物逆境诱导型启动子植物表达载体。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案是：所述植物表达载体包含上述的逆境诱导型启动子序列。本专利技术要解决的技术问题（三）是：提出一种使植物在低温、干旱和盐胁迫下诱导表达目标基因的方法。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案是：先将目标基因插入到含有上述启动子的植物重组载体中，再将该重组载体导入目标植物中，并在低温、干旱和盐胁迫条件下诱导目标基因在植物中进行表达。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的诱导型启动子属于多元诱导型启动子，能够在冷、干旱和盐胁迫条件下启动外源基因的表达。按照本专利技术提供的技术方案，将外源基因替换GUS基因插入到本专利技术的逆境诱导型启动子植物表达载体中，能够通过人为的控制环境条件（温度、湿度和盐含量），控制外源基因的表达，避免了因持续表达目标基因造成的能量浪费和可能性伤害。另外，将抗逆基因作为外源基因，利用本专利技术提供的诱导型启动子，可以在冷、干旱、盐胁迫下高效启动抗逆基因表达，增强植物的抗性。附图说明图1是本专利技术中启动子PCR扩增电泳图，其中M为DL2000Marker，条带大小至上而下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1为本专利技术启动子pBdDREB-47。图2是pCAMBIA1381-GUS载体和本专利技术启动子连接T载体后经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳图，其中M为DNAMarkerⅢ，条带大小至上而下为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；1为pBdDREB-47-T质粒；2为pCAMBIA1381-GUS质粒。图3是启动子连接pCAMBIA1381-GUS植物表达载体后菌液PCR电泳图，其中M为DL2000Marker；1-10为单克隆。图4是启动子连接pCAMBIA1381-GUS植物表达载体后EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定电泳图，其中M为DNAMarkerⅢ；1为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。图5是农杆菌菌液PCR检测电泳图，其中M为DL2000Marker；1-3为农杆菌单克隆；4为阴性；5为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。图6是部分T0代转基因烟草阳性检测电泳图，其中M为DL2000Marker；1-7为转基因烟草T0代单株；8为野生型烟草；9为pC1381-pBdDREB-47-GUS质粒。图7是本专利技术启动子植物表达载体构建示意图。图8是冷、干旱和盐胁迫处理前后转基因烟草GUS染色图。具体实施方式实施例一本实施例是关于二穗短柄草BdDREB-47基因启动子的克隆。1.1二穗短柄草基因组DNA的制备利用CTAB法提取正常生长的二穗短柄草的叶片，通过超微量核酸蛋白测定仪Q5000检测所提取的DNA的浓度与质量，将DNA浓度稀释至100ng/μl备用。1.2启动子的克隆以上述提取的二穗短柄草DNA为模板，利用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3引物，进行PCR扩增得到SEQIDNO:1序列。PCR反应体系如下：试剂体积（μl）ddH2O5.82×PrimeStarGCBuffer10dNTPmix（2.5mM）2上游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种逆境诱导型启动子，其特征在于：所述逆境诱导型启动子包含SEQ ID NO:1的1388bp的DNA核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种逆境诱导型启动子，其特征在于：所述逆境诱导型启动子包含SEQIDNO:1的1388bp的DNA核苷酸序列。2.根据权利要求1所述逆境诱导型启动子，其特征在于：所述逆境诱导型启动子的序列来自二穗短柄草AP2/EREBP家族基因BdDREB-47。3.一种逆境诱导型启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽丽，陈利红，李甜甜，高利芬，周俊飞，彭海，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42