CRISPR‑Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA制造技术

本发明专利技术公开了CRISPR/Cas9 靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性sgRNA。首先是获得特异性靶向RITA 基因第二外显子的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1 所示；其次是构建RITA基因的sgRNA到慢病毒载体系统，该系统含有Cas9 蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒感染人肠癌HT‑29细胞，获得RITA蛋白表达水平显著降低的细胞株。本发明专利技术具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好、且对RITA基因切割效率高；此外，所构建的CRISPR/Cas9慢病毒系统具有敲除效率高的优势，并能特异性敲除RITA基因，得到敲除RITA基因的人肠癌细胞，从而为进一步研究肠癌细胞中RITA的作用机制提供强有力的工具。

CRISPR Cas9 targeted knockout of human colon cancer cell RITA gene and its specific sgRNA

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA
本专利技术属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA。
技术介绍
RBP-J交互和微管相关蛋白(RITA;C12orf52)是一个高度保守的蛋白，蛋白大小为36kD，与任何其他蛋白质没有显著的同源性。RITA可以干扰Notch和RBP-J介导的转录。RITA在细胞核和细胞质之间快速穿梭，最重要的是，它介导RBP-J微管蛋白纤维的核输出。RITA，作为一个新的RBP-J交互蛋白，通过干扰转录因子RBP-J下调Notch。Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，它们调节从海胆到人等多种生物细胞的发育。Notch信号影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的特化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。转录因子RBP-J在调控Notch信号通路中有非常重要的作用，因为它在抑制和激活复合物中识别DNA靶序列。有研究表明在肝癌细胞中RITA的过表达增加p53和FBXW7蛋白的表达及下调cyclinD1、cyclinE、CDK2和NF-κBp65的表达。这些变化导致SMMC-7721和HepG2细胞的生长抑制和诱导G0/G1期细胞周期阻滞和凋亡。该结果表明RITA发挥肿瘤抑制作用是通过细胞周期G0/G1期阻滞和诱导细胞凋亡有关。RITA基因参与调控细胞周期，由于肿瘤有可能是因为细胞过度增殖造成的，因此，有必要研究RITA在不同细胞中的作用机制。肠癌是指发生于肠道的癌病类疾病，是胃肠道中常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌。目前，研究人员在肠癌的发生机制方面做了大量研究，发现了众多参与肠癌进展的途径和机制，如原癌基因激活、抑癌基因失活(点突变、重排、缺失)及染色体异常等，但目前肠癌发生与进展中所涉及的分子机制仍有许多尚未明确，需要进一步研究。CRISPR/Cas系统是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。CRISPRRNA（crRNA）与转录激活crRNA退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM（5’-NGG-3’）为spCas9识别位点，是实现剪切功能的关键。sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9特异性敲除目标基因的先决条件，脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9对目标基因的特异性敲除，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术。本专利技术利用CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得敲除RITA基因的人肠癌细胞，为研究肠癌细胞中RITA的作用机制提供有力工具。参考文献，1）HorvathP,BarrangouR(January2010)."CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea".Science327(5962):167–170；2）HaleCR,ZhaoP,OlsonS,etal.(November2009)."RNA-GuidedRNACleavagebyaCRISPRRNA-CasProteinComplex".Cell139(5):945–956；3）Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,andCharpentieE.(2012).Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivbacterialimmunity.Science337,816–821；4）Hsu,P.D.,Scott,D.A.,Weinstein,J.A.,Ran,F.A.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.J.,Wu,X.,Shalem,O.,etal.(2013).DNAtargetingspecificityofRNA-guidedCas9nucleases.Nat.Biotechnol.PublishedonlineJuly21,2013；5）HaiheWang,ZhanchunYang,ChunboLiu,ShishunHuang,HongzhiWang,YingliChen,andGuofuChen.(October2014).RBP-J-interactingandtubulin-associatedproteininducesapoptosisandcellcyclearrestinhumanhepatocellularcarcinomabyactivatingthep53–Fbxw7pathway.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications454(2014)71–77；6）S.A.Wacker,C.Alvarado,G.vonWichert,etal.,RITA,anovelmodulatorofNotchsignalling,actsvianuclearexportofRBP-J,EMBOJ.30(2011)43–56。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向敲除RITA基因的sgRNA序列。本专利技术的另一目的在于提供所述一种靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用。本专利技术的再一目的在于提供靶向敲除RITA基因的人肠癌细胞HT-29细胞的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种靶向敲除RITA基因的sgRNA序列，选自DNA序列如下的RITAsgRNA：RITAsgRNA的序列如下：RITAsgRNAoligo1：5’-CACCGCACCGGACTTCGATCCGCCC-3’；RITAsgRNAoligo2：5’-AAACGGGCGGATCGAAGTCCGGTGC-3’；一种靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除RITA基因的sgRNA的DNA序列。所述的靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：(1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体Lenti-CRISPRv2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；(2)将上述靶向敲除RITA基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统；步骤(2)中所述的DNA序列是将寡核苷酸链1(oligo1)和寡核苷酸链2(oligo2)退火得到双链序列；所述的靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除RITA基因的细胞株中的应用；一种敲除RITA基因的细胞株，是将所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR/Cas9 靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA，其特征在于，首先设计获得特异性靶向RITA 基因第二外显子的sgRNA；其次构建RITA基因的sgRNA到慢病毒载体系统；然后将此慢病毒载体系统感染人肠癌HT‑29细胞，得到的RITA基因敲除细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA，其特征在于，首先设计获得特异性靶向RITA基因第二外显子的sgRNA；其次构建RITA基因的sgRNA到慢病毒载体系统；然后将此慢病毒载体系统感染人肠癌HT-29细胞，得到的RITA基因敲除细胞株。2.根据权利要求1所述的特异性靶向RITA基因第二外显子的sgRNA，其DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述sgRNA在RITA基因上的靶序列是唯一的。3.根据权利要求2所述的特异性靶向RITA基因第二外显子的sgRNA，其引物包括针对RITA基因的靶点位于第二外显子上的引物对：RITAsgRNAoligo1：如SEQIDNO.2所示；RITAsgRNAoligo2：如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1所述的构建RITA基因的sgRNA到慢病毒载体系统，是一种靶向敲除RITA基因的CRISPR/Cas9重组表达慢病毒载体Lenti-CRISPRv2-hRITAsg，其特征在于：含有特异性靶向RITA基因第二外显子的sgRNA和Cas9蛋白的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQIDNO：8所示；根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA，其特征在于包括如下步骤：(1)提供sgRNA序列，所述sgRNA在RITA基因上的靶序列符合5’-N(19)G的序列排列规则，所述sgRNA在RITA基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA在RITA基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA在RITA基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在RITA上的靶位点序列如序列表SEQIDNO.1序列所示，在所述sgRNA在RITA上的靶位点序列的5’-端加上CACCG序列合成得到正向寡核苷酸即Forwardoligo；获得sgRNA在RITA上的靶位点序列的互补链，并且在互补链的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉涛，杨佳丽，杨兴林，潘讴东，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31