本发明专利技术公开了一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过染色体步移技术获得GliG基因的上游启动子序列并进行启动子核心区域预测，获得埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。本发明专利技术的启动子能够高效启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子，从而为后期通过转录调控和异源表达以提高胶霉毒素产量并获得更多高活性的新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。
A GliG promoter of FS110 glutathione thiotransferase gene FS110 and its application
The invention discloses a GliG promoter of the FS110 glutathione thiotransferase gene FS110 and its application. The nucleotide sequence of the promoter is shown as SEQ ID NO.1. In the present invention, the upstream promoter sequence of GliG gene is obtained through chromosome walking technology, and the core region of promoter is predicted. The promoter of Ed GliG glutathione s transferase gene GliG is obtained. The promoter of the invention can start the efficient expression of hygromycin resistance gene HPH, and the starting efficiency was significantly higher than that of pgpdA promoter and expression model of gliotoxin to improve gliotoxin production and get more high activity for molecular biology basis for post transcriptional regulation by heterologous and.
【技术实现步骤摘要】
一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用
：本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。
技术介绍
：埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110是从深海中分离得到的真菌。从中分离得到了具有很强抗肿瘤及降血压活性的新型化合物胶霉毒素，从埃德菌FS110中共获得胶霉毒素15种，其中8种为新型胶霉毒素。胶霉毒素具有抗肿瘤、抗真菌活性、抗病毒和免疫调节活性，因此在抗肿瘤、抗肝纤维化、抗病毒及免疫抑制剂药物开发方面具有良好的开发前景。启动子作为结构基因和功能基因转录调控的必要元件，能够募集转录因子与RNA聚合酶精确的起始转录。近年来，由于丝状真菌在新型、高活性次级代谢产物的发掘以及活性酶的研究和开发方面发展迅速，且丝状真菌中启动子对其内源基因的转录活性较高，因此很多不同种属丝状真菌的启动子相继被发掘，如里氏木霉(Trichodermareesei)的cbh1、tef1启动子，gpdA启动子，木霉属(Trichodermasp.)pki1启动子，曲霉属的glaA启动子等。但目前深海真菌次级代谢产物生物合成基因的启动子尚未被发掘。烟曲霉中胶霉毒素的生物合成基因簇已经被报道，而且已经证实GliG是胶霉毒素生物合成的关键基因(DolanSK,O'KeeffeG,JonesGW,etal.Resistanceisnotfutile:gliotoxinbiosynthesis,functionalityandutility[J].TrendsinMicrobiology,2015,23(7):419-428)。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子GliGP通过以下方法获得的：通过转录组测序获得编码谷胱甘肽硫转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliG，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在其上游序列中设计特异性反向引物sp1、sp2和sp3，采用Genomewalking试剂盒的通用正向引物AP3进行三轮巢式PCR扩增，每一轮扩增产物稀释后作为下一轮扩增的模板。最后一轮的扩增产物进行TA克隆，转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因GliG上游启动子序列，并利用启动子预测软件分析上游启动子序列，获得GliG启动子核心区域GliGP(即埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)。本专利技术设计2μ复制子正反向引物进行克隆，所采用引物为2μori-U：5’-GTTACCCCTGCAGGAACGAAGCATCTGTGCTTCATTT-3’，2μori-D：5’-GTTACCAAGCTTCATTGCGAATACCGCTTCCAC-3’。PCR扩增得到的2μ复制子片段用PstI和HindIII进行双酶切，再插入至用PstI和HindIII进行双酶切pAN7-1载体，用菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，从而成功将酵母2μ复制子插入到pAN7-1载体中，得到2μ-pAN7-1载体，然后利用酶切连接的方法，对GliG启动子核心区域GliGP设计BglII和PshAI酶切位点的上下游引物，PCR扩增并用BglII和PshAI双酶切，与BglII和PshAI双酶切后的2μ-pAN7-1载体连接转化，将目的基因GliG启动子核心区域GliGP(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)取代pgpdA启动子，构建得到2μ-pAN7-1-GliGP载体，并电转入酿酒酵母BY4742细胞中，利用200μg/mL潮霉素抗性的YPD平板进行筛选和验证。与无质粒和含有2μ-pAN7-1质粒的酿酒酵母BY4742相比，含有重组载体2μ-pAN7-1-GliGP的酿酒酵母生长较快，而且菌落数较多。证明GliG启动子核心区域GliGP能启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子。本专利技术的第二个目的是提供一种表达载体，含有上述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。本专利技术的第三个目的是提供一种宿主细胞，含有上述的表达载体。所述的宿主细胞优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742。本专利技术的第四个目的是提供上述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子在启动下游基因在宿主细胞中表达的应用。所述的宿主细胞优选为埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742。所述的下游基因优选为谷胱甘肽硫转移酶基因GliG或潮霉素抗性基因hph。本专利所涉及的埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110分离自3739米的深海，本课题组前期对该菌进行了转录组测序并对胶霉毒素生物合成相关基因进行了注释。鉴于目前关于埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110的启动子尚未见报道，而转录组测序及荧光定量PCR结果也表明，编码谷胱甘肽硫转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliG的表达水平较高，预示该基因的启动子具有较高的转录活性。因此本专利技术采用genomewalking试剂盒，利用通用引物和反向特异性引物，利用TAIL-PCR原理获得埃德菌FS110GliG基因的上游启动子序列，启动子核心区域预测获得启动子核心区域并进行功能验证，从而为后期通过转录调控和异源表达以提升胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。本专利技术的埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110，其公开于文献：杨小岚，陈玉婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生物技术通报，2014,8:132-137。该菌种本申请人也持有，保证自专利技术的申请日起20年内向公众提供。附图说明：图1是埃德菌FS110胶霉毒素生物合成基因表达水平；图2是埃德菌GliG启动子序列获得；其中A为GliG启动子的染色体步移扩增产物的电泳图，G-1为第一次巢式PCR扩增产物，G-2为第二次巢式PCR扩增产物，G-3为第三次巢式PCR扩增产物；B为菌液PCR扩增产物的电泳图；C为GliG启动子核心区域GliGP扩增产物的电泳图；图3是重组载体2μ-pAN7-1和2μ-pAN7-1-GliGP的构建；其中A为2μ-pAN7-1载体图谱；B为GliG启动子核心区域GliGP的菌落PCR扩增产物的电泳图；图4是不同浓度潮霉素抗性平板对酿酒酵母生长的影响；图5是2μ-pAN7-1-GliGP载体对酿酒酵母生长的影响；图6是GliG启动子核心区域GliGP的菌落PCR扩增产物的电泳图。具体实施方式：以下将参照附图，结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。而不是对本专利技术的限制。本实施例中Genomewalking试剂盒购买自Takara生物工程有限公司(大连，中国)；TA克隆试剂盒购买自全氏金生物工程有限公本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。3.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4742。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶伟，黄自磊，章卫民，李赛妮，朱牧孜，许建林，李浩华，刘桃妹，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44
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