本发明专利技术提供了一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。针对新核仁蛋白Rsl1d1的核苷酸序列设计合成siRNA，利用该分子干扰治疗靶点的表达，从而影响其功能，然后给肿瘤模型施用常用抗肿瘤药物，通过测量肿瘤体积和小鼠体重的变化，发现siRNA转入HCT116结直肠癌细胞及其实体瘤后能显著抑制其生长。
The application of a double stranded siRNA in the preparation of malignant tumor
The invention provides an application of a double stranded siRNA in the preparation of drugs for malignant tumors. The synthesis of siRNA designed according to the nucleotide sequence of new nucleolar protein Rsl1d1, RNAi target of treatment using the molecule, thus affecting its function, and then to the application of tumor model of antineoplastic drugs, by measuring tumor volume and body weight changes of mice, found that siRNA to HCT116 colorectal cancer cells and solid tumor can significantly inhibit the growth of.
【技术实现步骤摘要】
一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
技术介绍
核仁是细胞核内合成核糖体RNA和组装核糖体的重要场所（TanBC,etal.EpigeneitcsilencingofribosomalRNAgenesbyMybbp1a.JBiomedSci.2012;19:57）。最近发现，核仁是一个高度复杂的多功能核内区域[PedersonT.Theplurifunctionalnucleolus.NucleicAcidsRes.1998;26:3871-6.]。核仁的结构蛋白如nucleophosmin和nucleostemin以及核糖体蛋白如RPL6和RPL11等，具有促进肿瘤发生、调节细胞增殖和凋亡的功能，是潜在的肿瘤治疗靶点。Rsl1d1（RibosomalL1domain-containingprotein1)是新发现的一种核仁蛋白，该蛋白由细胞衰老抑制基因（CSIG）编码（郭淑贞等.衰老相关新基因CSIG的cDNA克隆和功能.中国生物化学与分子生物学报.2003:612-7），通过抑制PTEN的翻译延缓复制性衰老进程（MaL,etal.CSIGinhibitsPTENtranslationinreplicativesenescence.MolCellBiol.2008;28:6290-301）。最近发现，Rsl1d1是促进肿瘤细胞增殖的重要因素（ChengQ,etal.CSIGpromoteshepatocellularcarcinomaproliferationbyactivatingc-MYCexpression.Oncotarget.2015;6:4733-44）。我们最近发现（数据未发表），Rsl1d1沉默使肿瘤细胞发生凋亡。因此，Rsl1d1是一个潜在的肿瘤治疗靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。本专利技术以Rsl1d1为靶标，设计其特异性双链siRNA分子，并以PEI为载体，通过瘤内注射给药高效抑制肿瘤的生长，从而达到治疗肿瘤的目的。本专利技术的技术方案：本专利技术公开了一种双链siRNA分子，所述siRNA是靶向Rsl1d1mRNA的siRNA，其双链核苷酸序列如下：正义链：5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’反义链：5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’本专利技术还公开了上述的双链siRNA分子在制备恶性肿瘤的药物中的应用。所述恶性肿瘤包括结直肠癌。具体步骤如下：1.合成Rsl1d1siRNA（siRsl1d1）。根据siRNA的设计原则和Rsl1d1基因编码区的核苷酸序列，寻找长度为21nt的候选区域，选择GC含量为40-50%的siRNA序列，并用Blast进行比对，以确保没有同源性。最终选择靶序列为CGAAGGATGAACCCAATTCAA（SEQIDNo:1），对应编码区296-316核苷酸位点。合成的siRsl1d1序列如下：正义链：5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’（SEQIDNo:2）反义链：5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’（SEQIDNo:3）将上述序列委托上海吉玛公司进行化学合成。同时，该公司提供阴性对照siRNA（negativecontrolsiRNA，siNC），其序列如下：正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’（SEQIDNo:4）反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’（SEQIDNo:5）2.荧光定量PCR和免疫印迹法检测siRsl1d1对Rsl1d1基因的沉默效果：以聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）为siRNA载体，转染处于对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116，用荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测胞内Rsl1d1的mRNA和蛋白质水平，以评价该siRsl1d1分子的基因沉默效果。3.MTT法检测Rsl1d1基因的沉默对HCT116细胞增殖的抑制作用：将转染siRsl1d1的HCT116细胞接种至96孔细胞培养板，置二氧化碳培养箱继续培养，用MTT法在不同时间点检测细胞活力，以考察Rsl1d1基因的沉默对HCT116细胞增殖的影响。4.Rsl1d1基因的沉默对荷瘤小鼠的治疗效果：用常规方法制备HCT116荷瘤小鼠，每3天瘤内注射一次转染复合物，一共给药5次，其间测量肿瘤直径和小鼠体重，绘制肿瘤生长曲线和小鼠体重变化曲线，计算抑瘤率，15天疗程结束后，剥离肿瘤拍照，制作H&E染色组织切片，分析Rsl1d1基因表达的沉默是否导致肿瘤细胞凋亡、坏死。上述的双链siRNA分子在制备恶性肿瘤的药物中的应用。所述恶性肿瘤包括直肠癌。本专利技术突出效果：本专利技术设计的siRsl1d1分子能显著降低HCT116肿瘤细胞内Rsl1d1的表达水平，高效抑制体外培养的HCT116细胞增殖速率及其实体瘤的生长速率；经siRsl1d1转染复合物治疗后，荷瘤小鼠体内肿瘤的平均体积为生理盐水对照组的1/18，为siNC对照组的1/14.5，为阿霉素对照组的1/6.3；因此，本专利技术设计的siRsl1d1分子可用于制备治疗结直肠癌的药物。附图说明图1荧光定量PCR检测结果图。图2免疫印迹法检测结果图。图3MTT法检测siRsl1d1影响HCT116肿瘤细胞增殖的结果图。图4各试验组对HCT116结直肠癌治疗前后肿瘤体积的变化对比图。图5各试验组对HCT116结直肠癌治疗结束后的肿瘤实物大小对比照片。图6HCT116结直肠癌组织H&E染色结果图。图7各试验组对HCT116结直肠癌治疗前后小鼠体重的变化对比图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本专利技术的保护内容。实施例、合成Rsl1d1siRNA（siRsl1d1）根据siRNA的设计原则和Rsl1d1基因编码区的核苷酸序列，寻找长度为21nt的候选区域，选择GC含量为40-50%的siRNA序列，并用Blast进行比对，以确保没有同源性。最终选择靶序列为CGAAGGATGAACCCAATTCAA（SEQIDNo:1），对应编码区296-316核苷酸位点。合成的siRsl1d1序列如下：正义链：5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’（SEQIDNo:2）反义链：5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’（SEQIDNo:3）将上述序列委托上海吉玛公司进行化学合成。同时，该公司提供阴性对照siRNA（negativecontrolsiRNA，siNC），其序列如下：正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’（SEQIDNo:4）反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’（SEQIDNo:5）2、用siRNA转染HCT116细胞并评价其沉默效果在6孔细胞培养板中接种HCT116人结直肠癌细胞，2×105/孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，用1mg/mL聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双链siRNA分子，其特征在于，所述siRNA是靶向Rsl1d1 mRNA的siRNA，其双链核苷酸序列如下：正义链：5’‑CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT‑3’；反义链：5’‑UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种双链siRNA分子，其特征在于，所述siRNA是靶向Rsl1d1mRNA的siRNA，其双链核苷酸序列如下：正义链：5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’；反义链：5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新跃，丁笠，张智萍，韦治明，王小燕，孙若男，张杰，陈志强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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