一种shRNA‑cluster序列及其表达载体和用途制造技术

本发明专利技术提供一种shRNA‑cluster序列，本发明专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA‑cluster序列和CAR分子，本发明专利技术还提供了它们的用途。本发明专利技术通过miRNA‑cluster来源的序列特异性下调PD‑1，Tim‑3，Lag‑3三个受体的表达或下调PD‑1受体表达。本发明专利技术在利用CAR分子改造后的T细胞的同时抑制其表面多个抑制性受体的表达，从而增强其拮抗实体肿瘤微环境的抑制性，进而强有力地介导对肿瘤的杀伤，能更好的用于抗实体肿瘤免疫治疗。

A shRNA cluster sequence and its expression vector and application thereof

【技术实现步骤摘要】
一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途
本专利技术涉及一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途。
技术介绍
自CAR-T免疫技术在2011年针对CD19抗原的急性淋巴型白血病的临床试验取得成果并在2013年被Science杂志评选为当年十大科技突破之首开始，该技术获得的从科学界到金融界一致的好评。中国每年诊断的新发肿瘤患者超过300万人，多数肿瘤术后复发的概率超过50％，中位生存期不足5年，当前的传统治疗手段在面对大多数难治、复发的肿瘤时疗效捉襟见肘，研发可特异性浸润并有效拮抗实体肿瘤微环境进而介导对其的有效杀伤的CAR-T细胞具备重要的意义。相对于CAR-T细胞在血液型肿瘤取得的丰硕成果，CAR-T细胞在针对实体肿瘤的I期临床试验个体差异性极大，只有少量成功的案例，解决CAR-T对实体肿瘤的浸润与避免过早衰竭是攻克实体肿瘤细胞免疫疗法的关键。基于实体肿瘤的免疫疗法的发展，科学家研发了大量可特异性识别实体肿瘤表面抗原的单抗类药物，这些蛋白类药物为针对实体肿瘤的CAR-T免疫细胞疗法的研发提供了保障，例如用于治疗Her-2阳性结肠癌、卵巢癌的单抗类药物Trastuzumab(Herceptin)自2010年即被开发为可特异性识别并杀伤Her-2阳性肿瘤的CAR-T免疫细胞，用于治疗EGFR阳性的多种肿瘤的尼妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗均被开发为相关scFv为膜外域的CAR-T免疫细胞并开展了大量的临床试验。然而，除了少数取得了良好的预后效果，大多数针对实体肿瘤的临床试验结果并不理想，利用CAR-T免疫细胞疗法清除患者体内的实体瘤存在广泛的争议。除淋巴瘤之外，在利用对IL13Rα2抗原特异性CAR-T细胞治疗一位50岁的脑胶质瘤的患者的临床试验中，临床医生在超过220天对患者的肿瘤部位以及颅内共计开展了16次细胞回输后终于观察到肿瘤的消失。多个团队利用当前的CAR-T免疫细胞疗法在清除胰腺癌、前列腺癌等实体肿瘤的临床试验，证实了相关CAR-T细胞的安全性以及对肿瘤细胞有限的杀伤。究其原因，肿瘤微环境的抑制性使得CAR-T细胞无法像可溶性的单抗药物一样抑制并杀伤肿瘤细胞，因此针对实体肿瘤的CAR-T技术的研发的重点应偏向于增强CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润能力以及对肿瘤微环境中低氧条件的耐受能力。因此设计能够充分浸润肿瘤微环境，长期维持自我更新同时耐受低氧环境，进一步增强对实体肿瘤的杀伤并在体内持续存在行使免疫监视功能的下一代CAR-T免疫细胞技术是利用免疫细胞疗法攻克各种实体肿瘤的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种shRNA-cluster序列，本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA-cluster序列和CAR分子，本专利技术还提供了它们的用途。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案：一种shRNA-cluster序列，所述shRNA-cluster序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示。本专利技术通过miRNA-cluster来源的序列特异性下调PD-1，Tim-3，Lag-3三个受体的表达或下调PD-1受体表达。本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体是将如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的；所述表达载体表达上述所述的shRNA-cluster序列和CAR分子。将如SEQIDNO:1所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的表达载体称为PTL-CAR分子；将如SEQIDNO:2所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的表达载体称为P-CAR分子，所述如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示的序列和CAR分子由两个不同的启动子分别驱动，CAR分子可特异性识别靶向的抗原。P-CAR分子的结构如图1中的上图所示；PTL-CAR分子的结构如图1中的下图所示。优选地，所述基础载体为慢病毒载体。本专利技术提供了一种改造的CAR-T细胞，所述T细胞是将上述所述的表达载体转入CD8+T细胞中而得的。PTL-CAR分子改造的CD8+T细胞称为PTL-CAR-T细胞，P-CAR分子改造的CD8+T细胞称为P-CAR-T细胞。经体外长时间培养，PTL-CAR改造的CD8+T细胞介导表达Her2细胞系SK-OV3的杀伤及分泌细胞因子的效果更加明显。本专利技术提供了一种上述所述的改造的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)收集外周血单个核细胞并分离富集其中的CD8+T细胞，采用anti-CD3、anti-CD28和IL-2激活所述CD8+T细胞；(2)CD8+T细胞激活48小时后，以1ml/1×106细胞的比例加入如权利要求3所述的慢病毒表达载体进行感染，同时加入聚凝胺溶液，离心后继续培养；8～12小时后，进行第二轮感染，得到改造的CAR-T细胞。优选地，所述anti-CD3的使用浓度为1μg/mL，所述anti-CD28的使用浓度为1μg/mL，所述IL-2的使用浓度为10ng/mL。优选地，所述聚凝胺溶液的浓度为8μg/mL。本专利技术提供了一种扩增权利要求4所述的改造的CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：(1)将改造的CAR-T细胞以新鲜培养基重悬细胞，并加入IL-2和IL-7保持细胞状态；(2)改造后的第3天和第5天，根据细胞状态和增殖情况，对细胞添加完全RMPI1640培养基，细胞浓度维持在2×106/ml，并补充IL-2和IL-7，继续培养并及时传代，进一步扩增细胞。优选地，其特征在于，所述IL-2的浓度为10ng/mL，IL-7的浓度为10ng/mL。本专利技术提供了上述所述的shRNA-cluster序列在制备清除实体肿瘤细胞的制剂中的应用。本专利技术提供了上述所述的表达载体或如权利要求4所述的改造的CAR-T细胞在制备清除实体肿瘤细胞的制剂中的应用。本专利技术提供了一种改善CAR-T细胞功能的方法，所述方法是通过shRNA下调CAR-T细胞的PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体表达，或者下调CAR-T细胞的PD-1受体表达。本专利技术提供了PD-1受体、或者PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体联合作为靶点在改善CAR-T细胞功能的应用。本专利技术提供了下调CAR-T细胞的PD-1，Tim-3和Lag-3三个受体表达的shRNA或者下调CAR-T细胞的PD-1受体表达的shRNA在改善CAR-T细胞功能的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术中全新改造的PTL-CAR-T细胞在治疗SK-OV3荷瘤的NSG小鼠中，本专利技术中全新改造的PTL-CAR-T细胞相比已报道的CAR-T细胞，PTL-CAR-T细胞治疗组小鼠肿瘤的大小明显小于CAR-T细胞，且PTL-CAR-T细胞治疗组小鼠生存率明显优于CAR-T细胞。PTL-CAR-T细胞可以被特异性激活并大量分泌细胞毒性相关的细胞因子IFN-γ进而强有力地介导肿瘤的坏死。本专利技术在治疗CD19阳性Raji细胞荷瘤的NSG小鼠中，相比已报道的CAR-T细胞，PTL-CAR-T细胞介导表达CD19阳性的实体肿瘤的坏死效果更加明显，相关治疗组小鼠肿瘤的大小明显小于CAR-T细胞。附图说明图1为构建的PT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种shRNA‑cluster序列，其特征在于，所述shRNA‑cluster序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种shRNA-cluster序列，其特征在于，所述shRNA-cluster序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示。2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体是将如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示的序列，以及CAR分子的编码序列连接到基础载体上而得的；所述表达载体表达如权利要求1所述的shRNA-cluster序列和CAR分子。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体为慢病毒载体。4.一种改造的CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞是将如权利要求2或3所述的表达载体转入CD8+T细胞中而得的。5.一种如权利要求4所述的改造的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)收集外周血单个核细胞并分离富集其中的CD8+T细胞，采用anti-CD3、anti-CD28和IL-2激活所述CD8+T细胞；(2)CD8+T细胞激活48小时后，以1ml/1×106细胞的比例加入如权利要求3所述的慢病毒表达载体进行感染，同时加入聚凝胺溶液，离心后继续培养；8～12小时后，进行第二轮感染，得到改造的CAR-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，邹帆，卢丽娟，
申请(专利权)人：广州千扬生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44