肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和KAP1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA及其应用和KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。所述用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，所述抑制剂能够有效抑制KAP1编码基因的表达，从而显著抑制细胞的增殖。KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本发明专利技术通过检测临床肺癌组织及邻近正常肺组织中KAP1的表达水平，临床肺癌组织中KAP1的表达水平明显高于邻近正常肺组织的表达水平。通过抑制KAP1的表达水平，能够有效抑制细胞增殖和细胞迁移，为临床治疗肺癌提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。

Inhibitors of targeted therapy for lung cancer and their application and the application of KAP1 as drug targets in the screening of anti lung cancer drugs

The invention provides an inhibitor gRNA for targeting therapy of lung cancer, and its application and KAP1 encoding gene as a drug target in screening lung cancer drugs, and belongs to the field of biomedicine technology. The inhibitor gRNA used for targeting treatment of lung cancer, the inhibitor can effectively inhibit the expression of KAP1 encoding gene and thus significantly inhibit cell proliferation. The KAP1 coding gene is used as a drug target in the screening of anti lung cancer drugs. By detecting the expression level of KAP1 in clinical lung cancer tissues and adjacent normal lung tissues, the expression level of KAP1 in clinical lung cancer tissues is significantly higher than that in adjacent normal lung tissues. By inhibiting the expression level of KAP1, cell proliferation and cell migration can be effectively inhibited, providing a theoretical basis for clinical treatment of lung cancer and screening new drug targets.

【技术实现步骤摘要】
肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和KAP1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和KAP1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。
技术介绍
目前，肺癌属于世界上致死率较高的肿瘤，特别是非小细胞肺癌，严重地威胁着人类的健康和生命。因此,寻找有效的治疗肺癌药物与方法,彻底攻克肺癌,是当今我国乃至世界医学界的一个重要研究课题。近年来，肿瘤学的研究在我国及世界范围的发展均极为迅速，科技的不断进步对肿瘤的治疗有很大促进作用。随着肿瘤分子生物学研究的进步，对肺癌相关基因的研究也日益深入，确定了许多与肺癌生成的有关基因。如原癌基因ras、myc、erbB基因家族及重要的抑癌基因p53、Rb、Chr3p、5p、9p等。但是，肺癌基因的发生发展过程中，原癌基因和抑癌基因容易发生突变，使原本与肺癌相关的基因的检测方法受到了限制。由于肺癌相关基因的易突变性，使得靶点治疗肿瘤的方式成为主流。靶向治疗正是肿瘤治疗变革的产物，具有较低的不良反应和良好疗效，能明显提高患者的生活质量，还可以大幅度减低患者发生副作用的风险，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。作为抗肿瘤领域的世界领先者，罗氏公司现拥有5个能延长患者生存期的靶向治疗药物，其中3个产品已经在中国上市。靶向治疗药物具有较光明的治疗模式，因此，筛选出合适的药物靶标为开发多种抗癌药物提供新的思路和方向。与药物作用相关的靶或蛋白质主要有3类：①疾病相关(特异性)蛋白质；②生物标记分子；③信号传导分子。尽管目前现有技术中报道了关于肺癌的药物靶点的种类，但是有些靶点筛选的药物给药后会产生不良反应，例如药物毒副作用较强；还有一些药物靶点治疗效果不佳，容易导致延误患者病情，错过最佳的治疗时期。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用，所述抑制剂通过抑制KAP1的表达从而能够有效抑制肺癌细胞增殖和迁移。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术提供了所述的抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。本专利技术还提供了KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。优选的，所述KAP1编码基因TRIM28具有如序列表中SeqIDNo.2所示的核苷酸序列。优选的，所述抗肺癌的药物为抑制KAP1编码基因表达的抑制剂。优选的，所述抑制剂为所述的肺癌靶向治疗抑制剂。优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。本专利技术提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。所述抑制剂能够有效抑制KAP1编码基因的表达，从而显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移。本专利技术还提供了KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本专利技术通过检测临床肺癌组织及邻近正常肺组织中KAP1的表达水平，临床肺癌组织中KAP1的表达水平明显高于邻近正常肺组织的表达水平。通过分子生物学的方法使用CRISP/cas9技术成功的在肺癌A549细胞株中敲除KAP1。检测了敲除KAP1后通过细胞增殖实验、化疗药物敏感实验、transwell实验、划痕实验、细胞成球实验、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞周期、EMT实验、裸鼠移植瘤实验等对A549细胞生物学功能的影响，结果表明通过抑制KAP1的表达水平，能够有效抑制细胞增殖。目前对于KAP1在肺癌发生发展的作用还很少，本专利技术提供的应用，在肺癌发病机制中的作用进行了初步探索，为临床治疗肺癌提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。附图说明图1为实施例1中KAP1在肺癌患者的癌组织及癌旁正常组织中表达的结果图；图1-A为KAP1癌组织及癌旁正常组织中的表达图，图1-B为KAP1表达灰度统计图；图2是肺癌A549细胞敲除KAP1结果图及KAP1对A549细胞增殖的影响图；图2-A-左为KAP1敲除蛋白水平结果图；图2-A-右为KAP1敲除基因水平结果图；图2-B为KAP1对A549细胞增殖的影响图；图3是KAP1在肺癌A549细胞中对化疗药物CDDP敏感性的作用；图4是KAP1在肺癌A549细胞中对5-FU敏感性影响的可能机制；图4-A为KAP1在肺癌细胞中对5-FU敏感性的影响结果图；图4-B为KAP1在肺癌细胞中对5-FU敏感性的可能机制结果图；图5是KAP1对A549细胞的细胞周期的影响图；图5-A为流式细胞术检测野生A549细胞和KAP1敲除A549细胞的结果图；图5-B为细胞周期统计柱状图；图6是KAP1敲除对肺癌A549细胞迁移的影响图；图6-A为transwell结果图及统计柱状图；图6-B为划痕结果图及统计柱状图；图7是KAP1敲除对肺癌A549细胞EMT的影响图；图7-A为EMT标志物westernblot检测结果图；图7-B为EMT形态学改变结果图；图8是KAP1敲除对肺癌A549细胞干性及侵袭能力的影响图；图8-A为细胞干性表型——细胞成球结果图及统计柱状图；图8-B为细胞干性标志物westernblot检测结果图；图8-C为细胞侵袭表型—软琼脂克隆形成结果图及统计柱状图；图9是KAP1敲除对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的影响图；图9-A为裸鼠移植瘤结果图；图9-B为裸鼠移植瘤重量统计柱状图；图9-C为裸鼠移植瘤体积统计折线图；图9-D为裸鼠重量统计折线图；图9-E为裸鼠移植瘤HE染色结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术中，所述抑制剂通过人工合成方法获得。本专利技术中，所述抑制剂委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本专利技术中，所述抑制剂能够有效抑制肺癌细胞中KAP1编码基因的表达，从而使ERK会被异常激活，细胞增殖受到抑制。本专利技术提供了所述的抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。本专利技术中，所述抗肺癌药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的基因药物制备的技术方案即可。本专利技术还提供了KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。本专利技术中，所述KAP1编码基因TRIM28优选具有如序列表中SeqIDNo.2所示的核苷酸序列。KAP1蛋白优选具有如序列表中SeqIDNo.3所示的氨基酸序列。本专利技术中，所述抗肺癌的药物优选为抑制KAP1编码基因表达的抑制剂。所述抑制剂优选为上述方案中所述肺癌靶向治疗抑制剂。本专利技术中，所述肺癌优选为非小细胞肺癌。本专利技术中，为了验证所述药物靶标的作用，构建基因敲除细胞模型(记为细胞-KAP1-KO模型)。所述基因敲除细胞模型的方法，优选包括以下步骤：A.设计KAP1编码基因抑制剂gRNA的DNA寡核苷酸片段的正反向序列；B.将设计得到的正反向序列进行磷酸化，得到双链片段；C.将所述双链片段连接至质粒载体中，得到连接产物；D.将所述连接产物进行纯化；E.将纯化后的连接产物转染至肺癌细胞中，检测基因和蛋白的表达结果。本专利技术中，所述设计抑制剂的DNA寡核苷酸片段的正反向序列用软件没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的设计软甲即可。本专利技术实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌靶向治疗的抑制剂gRNA，具有如序列表中SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的抑制剂gRNA在制备预防和治疗抗肺癌药物中的应用。3.KAP1编码基因作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述KAP1编码基因具有如序列表中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐天瑞，吴国金，郭晓汐，黄颖，彭俊，安输，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53