一种双功能5′‑tri‑phosphate siGPC‑3及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种双功能5′‑tri‑phosphate siGPC‑3及制备方法与应用。是含有三磷酸基团的GPC‑3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。兼具基因沉默功能和RIG‑I激活功能。

A dual function of 5 'tri phosphate siGPC 3 and preparation method and Application

The invention discloses a double function of 5 'tri phosphate siGPC 3 and preparation method and application. Containing three phosphate groups of GPC 3 specific siRNA, justice chain from 5 'to 3' sequence is CCUUGCAGAACUGGCCUAU, the 5 'end modified three phosphate group, antisense chain from 5' to 3 'sequence is AUAGGCCAGUUCUGCAAGG, antisense strand 5' end modified with three phosphate groups. Both I and RIG gene silencing function activation function.

【技术实现步骤摘要】
一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3及制备方法与应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及RNA干扰(RNAi)技术治疗领域，具体涉及一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3及制备方法与应用。
技术介绍
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。但是，由于肝癌特别是肝细胞性肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发，使得采用上述治疗手段治疗肝细胞性肝癌的效果不明显，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)是近年来受到关注的靶点之一。该分子在肝癌组织中呈现特异性高表达，参与肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移过程，与肝癌的发生、发展密切相关。RNAi技术可作为技术手段用于新基因、新靶点的研究，并且还广泛应用于抗病毒和抗肿瘤的基础研究领域。无论是细胞水平，还是动物模型，基于RNAi技术的siRNA分子均取得明显的治疗效果。目前为止，以GPC3可作为肝癌治疗的靶点利用RNAi技术获得兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能的siRNA未见报道。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3，兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。本专利技术对靶向GPC3的siRNA进行设计，并在靶向GPC3的siRNA的5′端修饰三磷酸基团，5′端的三磷酸基团可被胞内天然免疫受体RIG-I识别，进而激活下游干扰素信号通路，因而使得制备的双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3具基因沉默功能和RIG-I激活功能。本专利技术的目的之二是提供一种制备上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3的DNA模板，包括GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4，所述GPC-3DNA正义链1与GPC-3DNA反义链2配对，所述GPC-3DNA正义链3与GPC-3DNA反义链4配对；所述GPC-3DNA正义链1由5′到3′的序列为：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT，所述GPC-3DNA反义链2由5′到3′的序列为：AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，所述GPC-3DNA正义链3由5′到3′的序列为：AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，所述GPC-3DNA反义链4由5′到3′的序列为：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCAGTTCTGCAAGGTT。本专利技术的目的之三是提供一种制备上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3的制备方法，将上述DNA模板中的GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4进行退火反应分别制备两种双链DNA，将两种双链DNA配置成RNA体外转录反应液进行体外转录反应，将体外转录反应后的产品经过纯化即得双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3。本专利技术的目的之四是提供一种上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3在制备治疗肝细胞性肝癌药物中的应用。本专利技术的目的之五是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，包括上述双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3。本专利技术的有益效果为：1.将本专利技术制备的双功能5′-tri-phosphatesiGPC3转染肝癌细胞Hep1-6细胞后，发现均能够下调肝癌细胞GPC-3基因的表达，并且显著抑制肝癌细胞增殖，促进其凋亡。在荷瘤小鼠模型中，5′-tri-phosphatesiGPC3可抑制Hep1-6细胞生长，并活化体内抗肿瘤免疫应答。2.本专利技术的体外转录的5′-tri-phosphatesiGPC3，转染Hep1-6细胞后，RIG-I通路可被显著激活并产生干扰素。可以作为抗肝癌的药物应用。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1为5′-tri-phosphatesiGPC3在Hep1-6细胞中的沉默作用检测，其中，A代表mRNA水平，B代表蛋白水平；图2为5′-tri-phosphatesiGPC3能抑制肝癌细胞的增殖，其中，A为抑制率，B为Ki67的mRNA水平，C图为Ki67蛋白表达；图3为5′-tri-phosphatesiGPC3能促进肝癌细胞的凋亡，其中，A为凋亡比例图，B为统计图，C图为凋亡相关蛋白表达；图4为5′-tri-phosphatesiGPC3能激活肝癌细胞RIG-I信号通路，其中，A为IFN-α/β的mRNA水平，B为IFN-α/β的蛋白水平；图5为5′-tri-phosphatesiGPC3体内抑瘤效果，其中，A为路线示意图，B肿瘤体积；图6为5′-tri-phosphatesiGPC3促进体内抗肿瘤免疫应答，其中，A为肿瘤组织CD4+T细胞比例和活化，B为肿瘤组织CD8+T细胞比例和活化，C为肿瘤组织内NK细胞比例和活化。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，以GPC3可作为肝癌治疗的靶点利用RNAi技术获得兼具基因沉默功能和RIG-I激活功能的siRNA未见报道，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3及制备方法与应用。本申请的一种典型实施方式，提供了一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU(SEQIDNO.1)，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG(SEQIDNO.2)，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。本专利技术对靶向GPC3的siRNA进行设计，并在靶向GPC3的siRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双功能5′‑tri‑phosphate siGPC‑3，其特征是，是含有三磷酸基团的GPC‑3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。

【技术特征摘要】
1.一种双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3，其特征是，是含有三磷酸基团的GPC-3特异性siRNA，正义链由5′到3′的序列为CCUUGCAGAACUGGCCUAU，其中，5′端修饰有三磷酸基团，反义链由5′到3′的序列为AUAGGCCAGUUCUGCAAGG，反义链的5′端修饰有三磷酸基团。2.如权利要求1所述的双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3，其特征是，作用的靶基因由5′到3′的序列为CCTTGCAGAACTGGCCTAT。3.一种制备权利要求1或2所述的双功能5′-tri-phosphatesiGPC-3的DNA模板，其特征是，包括GPC-3DNA正义链1、GPC-3DNA反义链2、GPC-3DNA正义链3、GPC-3DNA反义链4，所述GPC-3DNA正义链1与GPC-3DNA反义链2配对，所述GPC-3DNA正义链3与GPC-3DNA反义链4配对；所述GPC-3DNA正义链1由5′到3′的序列为：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCTTGCAGAACTGGCCTATTT，所述GPC-3DNA反义链2由5′到3′的序列为：AAATAGGCCAGTTCTGCAAGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，所述GPC-3DNA正义链3由5′到3′的序列为：AACCTTGCAGAACTGGCCTATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC，所述GPC-3DNA反义链4由5′到3′的序列为：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGATAGGCCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩秋菊，张彩，于馨，邵利伟，张建，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37