本发明专利技术提供了一种发生了c.133C>T突变的RanBP9突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，它是人类男性生精障碍的致病基因。本发明专利技术还提供了基于多重PCR捕获联合二代DNA测序的RanBP9致病基因外显子突变筛选方法，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQ ID NO:7‑12，用于Sanger测序的RanBP9基因c.133C>T突变片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:7‑8所示。本发明专利技术提供的RanBP9致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和检测方法的构建等提供依据和奠定基础。
Mutation of RanBP9 gene in 133 loci and its application
The invention provides a c.133C> T mutation occurred; the mutation of RanBP9 gene, the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2 shows, it is a human pathogenic gene of male spermatogenesis dysfunction. The invention also provides RanBP9 gene multiplex PCR acquisition in the two generation DNA sequencing exon mutation screening method based on using Sanger sequencing to verify the mutation; PCR capture primer set contains amplification primers SEQ ID NO:7 12, RanBP9 c.133C> Sanger for gene sequencing of the amplified fragments; T mutation primer sequences such as SEQ ID NO:7 8 shows. The RanBP9 pathogenicity gene form has not yet been reported, which can provide evidence for establishing the pathogenesis of the disease and constructing the detection method.
【技术实现步骤摘要】
133位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用
本专利技术涉及突变基因及其检测方法，特别涉及人类男性生精障碍致病基因RanBP9及其检测方法。
技术介绍
生育年龄的男性中约有5%有不育问题，其中大部分的原因不明。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由数个基因控制，这些基因的表达过程若受到干扰，就会影响精子的形成从而造成男性不育。研究（JianqiangBao,etal.,RAN-BindingProtein9isInvolvedinAlternativeSplicingandisCriticalforMaleGermCellDevelopmentandMaleFertility.PLoSGenetics.2014，10(12):1-14.）表明，RanBP9基因即RANbindingprotein9编码基因在老鼠睾丸中可以调控生育相关基因的表达，以保证精子的正常生成，因此RanBP9基因是目前精子形成过程中的关键调控因素之一。RanBP9基因编码RanBP9蛋白，RanBP9蛋白是在细胞内多个区域调节不同功能的多种蛋白复合体的关键组成部分，发挥支架蛋白的角色。RanBP9蛋白功能的发挥与多种生物过程相关，例如细胞增殖和凋亡、性腺的生长和发育等。如果RanBP9基因失去功能，精子的生成过程就会受到干扰，从而严重减低男性生育力造成男性出现少精、弱精等生精障碍。然而目前RanBP9基因在人类男性生精障碍中的遗传变异特征尚未得到解析，限制了该基因的研究和应用。为了系统解析RanBP9基因在人类男性生精障碍中的致病突变，本专利技术设计和合成了覆盖RanBP9基因全部外显子的PCR捕获引物组，再结合二代DNA测序技术对25个男性生精障碍患者样本进行捕获测序，最终解析出了RanBP9基因的6种候选致病突变形式，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对这6种致病基因突变，利用Sanger测序分析对应家系中其它成员的样本，发现携带致病基因突变的男性均存在生精障碍从而致病基因突变得到了确证。进一步的，采用同样的方法在另外37个人类男性生精障碍患者和100个生精正常的健康男性样本中进行了验证。本专利技术提供的男性生精障碍致病基因RanBP9突变均尚未见报道，其对于该病的解析和检测均具有潜在的重要价值。
技术实现思路
本专利技术提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的6种突变基因形式，同时提供了基于PCR捕获测序的RanBP9致病基因检测方法；这些可以为RanBP9基因引起的男性生精障碍致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测等提供依据和奠定基础。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术提供了RanBP9基因的6种突变基因形式（图1），其序列分别如SEQIDNO:1-6所示，对应的突变分别为c.126C>T突变、c.133C>T突变、c.702T>G突变、c.912G>T突变、c.921A>G突变和c.926delC突变。RanBP9基因的这6种突变形式经检测和验证，均为人类男性生精障碍致病基因，可以被应用于构建人类男性生精障碍基因检测方法以及制备人类男性生精障碍基因诊断芯片、基因检测试剂盒和治疗药物中。其中，所述SEQIDNO:1-6展现的只是发生了突变的RanBP9基因外显子序列，不含内含子序列。参照野生型RanBP9基因序列（NCBI登录号为NM_005493.2），所述c.126C>T突变是指RanBP9基因第126位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述c.133C>T突变是指RanBP9基因第133位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述c.702T>G突变是指RanBP9基因第702位点的T核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子2中；所述c.912G>T突变是指RanBP9基因第912位点的G核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.921A>G突变是指RanBP9基因第921位点的A核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.926delC突变是指RanBP9基因第926位点发生了C核苷酸的缺失，该突变发生在外显子4中。此外，本专利技术还提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的致病基因检测方法，该方法包括如下主要步骤：（1）RanBP9基因的PCR捕获提取待测患者样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行多重PCR扩增；（2）二代DNA测序解析基因突变谱将（1）中的多重PCR扩增产物进行二代DNA测序，并通过信息分析找出突变位点；（3）突变位点的验证对于结果是已发现的6种RanBP9基因致病突变的，则直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现的RanBP9基因突变的，则进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的遗传信息进行验证。其中，（1）中所述样本为人体正常组织，优选血液或口腔粘膜。其中，（1）中所述PCR捕获引物组是针对RanBP9基因外显子区设计的，共需要15对引物（其序列如表1所示），在美国ThermoFisher公司处定制，这15对引物对构成的PCR捕获引物组可以覆盖RanBP9基因所有外显子。SEQIDNO:7-12也包含在这15对引物对中。表1PCR捕获扩增引物组扩增子编号引物上游序列（5’-3’）引物下游序列（5’-3’）Amplicon1GAAGCAGAGGAGGAAGGAGATTGTAGTGCACCCGCAGGAmplicon2GTCATGGCAAAACCCCAACCATCTCTTCCCTTACTGACAmplicon3TTACATGGGAATTGGTCTTCTGGTAGTCTATTCATGTTCAmplicon4GTTGGGATAAGCATTCATATCTAAACTATGTCCATTCTTGAmplicon5GTATTGCTTTCACTGACCTGCGCGGTGGCTCACGCCAmplicon6CCAAATTTGTATCCTACTGTTTGTATCATGGTCTGCCAAmplicon7AATGGTTTCATCTTATTTATGTCTATTCTTAATGGAAAmplicon8GAATTCAGAAATTGGTATTTTAATGTGAAAAGGAGATTAmplicon9AGTGCGTCAGTTTATAGAAATGAAAAATGTGCGGTGCTTAmplicon10GTTTTGAAAGTTGTAGTACTGGTGAAGTTATTAACTTGAmplicon11TAATGATGTAGACATGGAAACATTTCGGTGTCACAATCTAmplicon12AAGTTGATTCAAGTCAGTTCTTCAACATTTTTTTGTTTGAmplicon13GATGCATTCAGTCTACTAGCTAATATTGCACTGTTAAGAAmplicon14AAACCCACAATCTGCCAAAGTGTGATGATCAATTTGAACAmplicon15ATCCTTTAAAACAATTACCCT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RanBP9突变基因，其特征在于RanBP9基因第133位点的C核苷酸突变成了T核苷酸即发生了c.133C>T突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种RanBP9突变基因，其特征在于RanBP9基因第133位点的C核苷酸突变成了T核苷酸即发生了c.133C>T突变，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的RanBP9突变基因在构建人类男性生精障碍基因检测方法以及制备人类男性生精障碍基因诊断芯片、基因检测试剂盒和治疗药物中的应用。3.如权利要求2所述的人类男性生精障碍的基因检测方法,其特征在于检测靶标为RanBP9基因，主要步骤如下:（1）RanBP9基因的PCR捕获提取待测患者样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行多重PCR扩增；（2）二代DNA测序解析基因突变谱将（1）中的多重PCR扩增产物进行二代DNA测序，并通过信息分析找出突变位点；（3）突变位点的...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志清，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：黄志清，
类型：发明
国别省市：福建,35
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