LDLR基因突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了LDLR基因突变体及其应用，涉及分离的编码LDLR突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法、筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒、包括LDLR突变体的核酸的突变体和重组细胞以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。其中，该分离的编码LDLR突变体的核酸，与SEQ NO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T，使所述LDLR基因的表达终止。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可有效地检测生物样品是否易感高胆固醇血症疾病。同时该LDLR基因突变体重组蛋白可以降低血浆中低密度脂蛋白胆固醇浓度。

【技术实现步骤摘要】
LDLR基因突变体及其应用
本专利技术涉及LDLR基因突变体及其应用。具体地，本专利技术涉及分离的编码LDLR突变体的核酸、一种分离的多肽，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。
技术介绍
家族性高胆固醇血症(Familialhypercholesterolemia，FH)是一种严重的常染色体显性单基因遗传性疾病。世界范围内FH杂合患者的发病率为1/500，成为最常见的代谢性疾病之一。纯合子患者症状严重，发病率为1/1000000，血浆低密度脂蛋白胆同醇(Lowdensitylipoproteincho1esterol，LDL-c)水平大幅度增高，多部位肌腱黄色瘤和早发动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)，严重者青少年时期可发生冠心病甚至心梗死亡。LDLR基因突变是FH的主要病理基础，在临床确诊的FH患者中约50％可检测到LDLR基因突变。目前为止，英国FH的LDLR突变数据库(http：www.ucl.ac.uk/ldlr/LOVDv.1.1.0/)报道世界范围内LDLR基因突变有l,741种。有关我国人群FH的报道较少。LDLR基因位于第19号染色体短臂(Chl9p13.1.13.3)，全长45kb，由18个外显子和17个内含子组成，编码含有839个氨基酸的前体蛋白。LDLR基因外显子区域可与LDLR蛋白7个结构域相对应：(1)启动子翻译信号区域；(2)外显子l编码的5’端序列及信号肽；(3)外显子2-6编码LDLR配体结合域；(4)外显子7-14编码EGF前体结构域；(5)外显子15编码LDLR氧连接糖链结构域；(6)外显子16和17编码跨膜结构域；(7)外显子17和18编码的胞浆区。细胞内新合成的LDLR前体由860个氨基酸残基组成，分子量120KDa，在由内质网向尔基体转运中，切去由21个氨基酸残基组成的信号肤，加上18个氧连接和2个氮连接的寡糖链，成熟LDLR分子量160KDa，于合成后约45分钟时到达细胞表面，并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coatediPt)内。LDLR与LDL结合后，在有被小窝内吞成内体，多个内体相互融合为不规则的大泡，大泡膜上质子泵的活性使泡内pH降至6.5以下，在此酸性条件下，LDLR与LDL分离，前者回到细胞表面重新起作用，后者则进入溶酶体,在多种水解酶作用下分解代谢。LDLR基因突变引起细胞膜表面的LDL-R缺如或结构功能异常，导致肝脏对血循环低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)清除障碍并在组织内过度淤积。家族性高胆固醇血症亚型之一的常染色体隐性家族性高胆固醇血症(autosomalrecessivehypercholesterolemia，ARH)，目前大多数ARH为LDLRAP1突变患者。ARH表型和LDLR纯合子相似，但同一ARH家系不同个体可有不同表型，并且较LDLR突变患者血清TC和LDL-c水平稍低，HDL-c稍高，无论辅以LDL血浆置换治疗，其对降脂药物的反应均较LDLR纯合FH患者敏感。ARH患者中冠心病的发病可相对延迟，目前报道病例的冠心病均发生于20岁之后，而FH纯合患者中超过40％的个体在20岁之前已发展为冠心病。本研究中，我们首次发现常染色体隐性高胆固醇血症LDLR突变患者。由于LDLR对于胆同醇代谢至关重要，以致该基因任何部位出现突变均可致病。以LDLR蛋白合成与功能为基础突变可划分为5型：l型突变为不表达等位基因，包括启动子序列突变、无义突变、移码突变、剪接突变，这类突变导致细胞不表达LDLR；2型突变为转运缺陷型等位基因，主要发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域，虽然能合成受体，但从内质网向高尔基体的转运障碍，堆积在内质网中最终被降解；3型突变为结合缺陷型等位基因，本型较常见，特点为突变基因编码的异常受体蛋白可以到达细胞表面，但丧失了结合LDL的功能，这类突变同样发生在配体结合域和表皮生长因子前体结构域；4型突变为内移缺陷型等位基因，本型罕见，发生在胞浆区域或是跨膜域，由于编码NPVY序列的密码子发生突变而致，特点为受体能与LDL结合，但不能将其转运至细胞表面并聚集于被覆陷窝；5型突变为再循环缺陷型等位基因，受体能够结合LDL，也能内移进人细胞，但在溶酶体内不能与LDL分离，受体与配体被同时降解，导致LDLR不能够再循环到细胞表面，这类突变多发生在表皮生长因子前体结构域。而在我们的研究中，首次发现在氧连接糖链结构域发生终止突变，导致突变的LDLR不能正确的锚定在细胞膜上并分泌到胞外。分泌后的突变蛋白仍然具有LDL结合活性，但是转运LDL至肝细胞进行降解的效率降低。随着基因检测技术的发展，将有等多的LDLR基因突变被我们发现，为FH的基因诊断和治疗提供依据。目前最重要的降胆固醇药物有三类，即他汀类、胆固醇吸收抑制剂(依折麦布)与PCSK9抑制剂。这三类药物分别作用于胆固醇代谢的不同环节而发挥降低胆固醇的作用。他汀类药物是降低胆固醇最主要的药物，有非常好的风险-得益比，但是他汀类药物面临的两大严重问题：第一，15％患者对他汀类药物不耐受，临床实践中多少患者对大剂量、高强度他汀的依从性并不清楚；第二是他汀类药物有无法逾越的6％瓶颈(初始剂量基础上，剂量翻倍，降低LDL-c的效果仅增加6％，但副作用的风险却大幅增加)。新药依折麦布或者PCSK9抑制剂的临床得益并不弱，但是费用昂贵。本研究中，LDLR突变体重组蛋白能够降低血清中的LDL-c，为高胆固醇血症的治疗提供新的思路与方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种分离的编码LDLR突变体的核酸、一种分离的多肽，该突变位点位于氧连接糖链结构域，使得LDLR突变体不能正确的锚定在细胞膜上而分泌到胞外，分泌的突变体蛋白仍具有LDL结合活性。本专利技术还涉及一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的系统，一种筛选易感高胆固醇血症的生物样品的试剂盒以及降低血浆低密度脂蛋白胆固醇的LDLR基因突变体重组蛋白。LDLR基因突变体重组蛋白，不同于其他降脂药物的抑制胆固醇合成或抑制胆固醇吸收而降低血浆胆固醇，重组蛋白直接改善LDL-c的受体LDLR。LDLR基因突变体重组蛋白作为一种蛋白类药物，具有高活性，特异性强，低毒性，生物功能明确，有了利于临床应用的特点。根据本专利技术的第一方面，提供了一种分离的编码LDLR基因突变体的核酸，该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。根据本专利技术的另一方面，提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽与SEQIDNO:2相比，所述分离的多肽具有选自下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的编码LDLR基因突变体的核酸，其特征在于，该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQ NO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。

【技术特征摘要】
1.一种分离的编码LDLR基因突变体的核酸，其特征在于，该核酸包括下列目标片段，所述目标片段与SEQNO：1相比，具有选自下列的至少一种突变：c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T。2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDNO:2相比，所述分离的多肽具有选自下列的至少一种突变：p.Q722X、p.D716X、p.E723X、p.K730X、p.Q739X、p.R744X以及p.E763X。3.一种非诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)从待检测生物样品提取核酸样本；(2)以步骤(1)中的核酸样本为模板特异性扩增LDLR基因，回收纯化扩增产物，并确定所述扩增产物的核酸序列；(3)判断步骤(2)所述核酸序列与SEQIDNO:1相比，是否具有c.C2164T、c.G2146T、c.G2167T、c.A2188T、c.C2215T、c.C2230T以及c.G2287T突变，若有其中至少一种突变，则步骤(1)中所述的生物样品即为易感高胆固醇血症的生物样品。4.一种非诊断和治疗目的的筛选易感高胆固醇血症的生物样品的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)从待检测生物样品提取总蛋白样本；(2)确定步骤(1)所述总蛋白样本中LDLR基因表达的多肽；(3)判断步骤(2)所述多肽与SEQIDNO:2相比，是否具有选自下列的至少一种突变：p.Q722X、p.D716X、p.E723X、p...

【专利技术属性】
技术研发人员：凃欣，周颖超，谢强，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42