一种甘薯GIGANTEA基因启动子、表达盒、重组表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种甘薯GIGANTEA基因启动子，其核苷酸序列为：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.1具有90％以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体。本发明专利技术还涉及启动子IbGIPo在调控下游基因表达中的应用，可以在根、茎、叶、花中驱动GUS基因大量表达。本发明专利技术所提供的启动子序列位于甘薯GIGANTEA基因上游，为植物激素和胁迫相关的响应元件，可以启动并调控GIGANTEA基因的表达来诱导甘薯的抗胁迫反应，并有助于促进人们对甘薯响应胁迫的研究，在农业领域具有广阔的应用前景。

A promoter, expression box, recombinant expression vector and its application of GIGANTEA gene in sweet potato

The invention discloses a sweet potato GIGANTEA gene promoter and its nucleotide sequence is: (1) nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown; or (2) has more than 90% homologous nucleotide sequence and promoter function with SEQ ID NO.1. The invention also provides an expression box containing the promoter and a recombinant expression vector. The invention also involves the application of promoter IbGIPo in regulating the expression of downstream genes, which can drive a large number of GUS genes in roots, stems, leaves and flowers. The promoter sequence of the GIGANTEA gene is located upstream of sweet potato, plant hormones and stress responsive elements related to the expression and regulation of GIGANTEA gene can start to induce potato anti stress reaction, and help to promote the research of sweet potato in response to stress, and has broad application prospects in the field of agriculture.

【技术实现步骤摘要】
一种甘薯GIGANTEA基因启动子、表达盒、重组表达载体及其应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种基因启动子，具体涉及一种甘薯GIGANTEA基因启动子、表达盒、重组表达载体及其应用。
技术介绍
植物在自然生长过程中会受到各种逆境胁迫，主要包括生物胁迫与非生物胁迫。随着人类社会的发展，非生物胁迫对植物正常生长的影响越来越严重。大量研究表明，GIGANTEA基因在植物耐逆胁迫调控上有着关键作用，其参与了植物抵御干旱、盐碱、寒冷、氧化等众多非生物胁迫反应。启动子是一类与启动基因表达相关的顺式作用元件，通过与特定的转录因子结合，控制基因的转录起始与表达，从而调节着植物细胞内的各种生化反应和应答模式。启动子可以通过调控外源基因在受体中的表达，提高作物对不同胁迫的响应，进而提高作物的抗性与品质。甘薯是我国重要的经济、能源以及粮食安全作物，与水稻、小麦等主要作物相比，具有高产、耐逆、耐贫瘠等优点。因此，开展甘薯GIGANTEA基因启动子的相关研究对于探索甘薯应答各种非生物胁迫机制以及选育甘薯耐逆新品种都具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种甘薯GIGANTEA基因启动子，可以高效启动GIGANTEA基因的表达。为实现上述目的，本专利技术提供的甘薯GIGANTEA基因启动子，命名为启动子IbGIPo，其核苷酸序列选自下列中的一种：(1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；(2)与SEQIDNO.1具有90％以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。本专利技术的目的之二是提供一种表达盒。为实现上述目的，本专利技术提供的一种表达盒，其包含上述甘薯GIGANTEA基因启动子以及目的基因，所述目的基因与所述甘薯GIGANTEA基因启动子连接。本专利技术的目的之三是提供一种重组表达载体，可以驱使外源基因在目标植物中表达。为实现上述目的，本专利技术提供的一种重组表达载体，其含有上述甘薯GIGANTEA基因启动子。所述重组表达载体为将上述启动子IbGIPo插入植物双元表达载体中，并连接于目的基因序列上游得到。优选地，所述植物双元表达载体为pMDC163载体，所述目的基因为GUS基因。本专利技术的目的之四是提供上述甘薯GIGANTEA基因启动子的应用。为实现上述目的，本专利技术提供上述启动子IbGIPo在调控下游基因表达中的应用。优选的，所述下游基因为GUS基因。具体研究步骤如下：(1)将上述IbGIPo启动子插入pMDC163载体中，并连接于GUS基因上游，得到重组表达载体，将该重组表达载体命名为pMDC163-IbGIPo-GUS；(2)将步骤1得到的重组表达载体pMDC163-IbGIPo-GUS通过农杆菌介导的方法对目标植物的花蕾进行遗传转化；(3)利用转化后的种子培育相应植株，(4)对步骤3得到的转基因植株不同组织器官进行GUS染色观察。在所述植株中，甘薯GIGANTEA基因启动子IbGIPo能够驱动重组质粒中的GUS基因的表达。优选地，所述目标植物为拟南芥，更优选为拟南芥Col-0。本专利技术具有下列有益效果：(1)本专利技术首次分离了甘薯GIGANTEA基因的上游启动子序列，该启动子序列可以驱动GUS基因在拟南芥中的表达，并分析了该启动子存在脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)等植物激素响应位点以及高、低温等胁迫应答元件；(2)本专利技术所提供的启动子序列可以在根、茎、叶、花中驱动GUS基因大量表达，是一种能高效表达外源基因的启动子，可应用于基因遗传转化和转基因植株培育中；(3)本专利技术所提供的启动子序列位于甘薯GIGANTEA基因上游，为植物激素和胁迫相关的响应元件，可以启动并调控GIGANTEA基因的表达来诱导甘薯的抗胁迫反应，并有助于促进人们对甘薯响应胁迫的研究，在农业领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术甘薯GIGANTEA基因启动子的PCR扩增电泳图。图2为本专利技术构建的重组表达载体pMDC163-IbGIPo的示意图。图3为本专利技术重组表达载体pMDC163-IbGIPo转化农杆菌后菌落PCR鉴定电泳图。图4为甘薯GIGANTEA基因启动子IbGIPo转化拟南芥后的GUS染色图；其中(A)阴性对照(非转基因)；(B)成熟叶片；(C)根；(D)茎和花蕾。具体实施方式下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1甘薯GIGANTEA基因启动子的分离(1)甘薯基因组DNA的制备取种植于温室的两个月大的甘薯(甘薯品种徐紫薯8号)嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，经分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存。(2)启动子IbGIPo的克隆和序列分析根据NCBI中提供的甘薯近缘野生种日本牵牛(Ipomoeanil)的全基因组序列，设计扩增甘薯启动子的引物。引物序列如下：引物1：5’–ATCTCGATTACCATTCTAAATGAGT-3’(SEQIDNO.2)引物2：5’–TAAGAAAAGCATGGTGACAAGT-3’(SEQIDNO.3)以步骤1中准备好的DNA为模板，用正向引物1和反向引物2进行PCR反应。PCR反应体系如下：1×PrimeSTARbuffer(Mg2+plus)，0.2mMdNTPs，1.0UPrimeSTARMaxDNA聚合酶(三者均购自大连TAKARA公司)，100ngcDNA，正、反向引物各0.45uM，ddH2O补充至终体积50ul。热循环参数为：98℃1min；98℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-225型PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，见附图1。将PCR产物连接到gateway系统入门载体(Invitrogen,美国)上，TA克隆并进行PCR检测，提取入门质粒并经由生工生物工程(上海)股份有限公司测序获得长度为1487bp的启动子，命名为启动子IbGIPo，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。然后使用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子IbGIPo的核苷酸序列进行分析，发现该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件TATA-box和CAAT-box，还含有MeJA、SA、GA等植物激素应答元件以及HSE、LTR、TC-richrepeats等胁迫相关响应元件，该序列的主要应答元件见表1，在甘薯生产中具有重要的应用价值。表1IbGIPo启动子区域应答元件实施例2植物重组表达载体的构建将实施例1中的含有IbGIPo启动子序列的重组入门载体与gateway的植物表达载体pMDC163-GUS(由中国科学院遗传与发育生物学研究所赠予)进行LR反应，转化大肠杆菌感受态细胞后通过PCR方法来确定阳性重组表达载体，从而使实施例1得到的启动子IbGIPo与GUS基因融合，得到表达GUS基因的植物重组表达载体pMDC163-IbGIPo-GUS，见图2。实施例3甘薯GIGANTEA基因启动子IbGIPo驱动下游GUS基因的表达(1)农杆菌介导的植物转化将实施例2中构建的含有GUS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘薯GIGANTEA基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列选自下列中的一种：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO.1具有90％以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种甘薯GIGANTEA基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列选自下列中的一种：(1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；(2)与SEQIDNO.1具有90％以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。2.一种表达盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的甘薯GIGANTEA基因启动子以及目的基因，所述目的基因与所述甘薯GIGANTEA基因启动子连接。3.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的甘薯GIGANTEA基因启动子。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1所述的甘薯GIGANTEA基因启动子插入植物双元表达载体中，并连接于目的基因序列上游得到。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述植物双元表达载体为pMDC163载体，所述目的基因为GUS基因。6.权利要求1所述的甘薯GIGANTEA基因启动子在调控下游基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐维，李强，张允刚，后猛，刘亚菊，王欣，闫会，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州甘薯研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32