一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种siRNA及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。所述siRNA可以敲低lncRNA TCONS_00179042在PAM细胞中的表达，从而有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述lncRNA TCONS_00179042能够促进PRRSV病毒复制，为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标lncRNA TCONS_00179042；为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选lncRNA。

The application of a PRRSV infection related lncRNA and its siRNA in inhibition of virus replication

The present invention relates to a siRNA and its application in the suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The expression of siRNA can knockdown of lncRNA TCONS_00179042 in PAM cells, which can effectively inhibit porcine reproductive and respiratory syndrome virus; the lncRNA TCONS_00179042 can promote the replication of the PRRSV virus, anti PRRSV drugs for viral replication studies provide a new target of lncRNA TCONS_00179042; lays the foundation for the development of new antiviral strategy, also provides a candidate lncRNA for the study of host antiviral mechanism after PRRSV infection.

【技术实现步骤摘要】
一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用
本专利技术涉及非编码RNA
，具体涉及一种PRRSV感染相关长链非编码RNA(lncRNA)及其干扰RNA(siRNA)在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害我国养猪业的重要疫病，其致病病毒PRRSV是一种单股正链RNA病毒，主要感染肺泡巨噬细胞(PAM)、成熟单核细胞、小胶质细胞等抗原递呈细胞，造成母猪流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸道疾病。猪繁殖与呼吸综合征是病毒病，在未感染前可以注射弱毒疫苗或灭活疫苗进行预防，但是现有的疫苗的保护性免疫效果有限，对异源毒株的保护效果差，疫苗免疫不能消除持续带毒现象，弱毒疫苗免疫群体内流行毒株与疫苗毒株的基因重组现象比较普遍，为变异株的产生提供了条件。因此，针对PRRSV流行的复杂局面，需要发现新的抗病毒免疫或治疗策略，解决目前PRRS防控中存在的困难。PRRSV感染相关的长链非编码RNA(lncRNA)在病毒感染致病过程中发挥着重要的作用，lncRNA分子对病毒的复制可能有促进或抑制作用，对其结构与功能进行研究，将有可能发现新的抗病毒方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种siRNA及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。本专利技术提供了一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。本专利技术还提供了所述的siRNA在敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达中的应用。优选的，所述siRNA对lncRNATCONS_00179042的敲低效率为45～55％。本专利技术还提供了所述的siRNA在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。本专利技术还提供了所述的lncRNATCONS_00179042作为靶点在开发治疗和预防PRRSV的药物和疫苗中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，所述siRNA可以敲低lncRNATCONS_00179042在PAM细胞中的表达，从而有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述lncRNATCONS_00179042能够促进PRRSV病毒复制，本专利技术提供的siRNA能够敲低lncRNATCONS_00179042的表达，为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标lncRNATCONS_00179042；为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选lncRNA。附图说明图1为PAM细胞接种VR2332毒株24小时后实时荧光定量PCR测定lncRNATCONS_00179042表达量结果示意图；图2为PAM细胞中siNC和siTCONS_00179042干扰小RNA对siTCONS_00179042的干扰效率示意图；图3为PAM细胞中siNC和siTCONS_00179042干扰小RNA，对PRRSV的复制抑制作用示意图；图4为lncRNATCONS_00179042琼脂糖凝胶电泳结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，具体序列如下：GCGCUUUCAGAACUGCAAU；所述siRNA为人工合成序列，所述siRNA优选的委托生物公司合成。在本专利技术中所述siRNA可以特异的敲低肺泡巨噬细胞(PAM)中lncRNATCONS_00179042的表达；所述siRNA对lncRNATCONS_00179042的敲低效率优选的为45～55％，更优选的为50％。在本专利技术中所述的lncRNATCONS_00179042的表达与病毒PRRSV复制相关，lncRNATCONS_00179042可以作为抑制病毒PRRSV复制的新靶标。在本专利技术中，所述siRNA通过敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042的表达水平来抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。具体的在本专利技术实施过程中siRNA敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达的方法为：将siRNA和Lipofectamine2000Reagent的混合液加入到PAM细胞中培养；培养结束后提取细胞总RNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测TCONS_00179042表达水平。在本专利技术中所述siRNA和Lipofectamine2000Reagent的混合液的溶剂优选的为Opti-MEM培养基。所述混合液中siRNA的浓度优选的为150～250pmol/ml，更优选的为200pmol/ml；所述混合液中Lipofectamine2000Reagent优选的为市售商品，所述的Lipofectamine2000Reagent浓度优选的为8～12μl/ml，更优选的为10μl/ml。在本专利技术中，所述培养前优选的还包括向PAM细胞中添加Opti-MEM培养基；在本专利技术中，所述PAM细胞优选的提前接种在六孔板中，所述Opti-MEM培养基的添加量优选的为每孔1.5ml；所述PAM细胞的密度优选的为40～60％，更优选的为50％。在本专利技术中所述培养的温度优选的为37℃恒温、培养环境优选的为5vol％CO2；所述培养的时间优选的为22～26h，更优选的为24h。在本专利技术具体实施过程中优选的采用恒温培养箱来进行所述培养。本专利技术在培养完成后，收集细胞，检测lncRNATCONS_00179042表达水平。在本专利技术中所述检测lncRNATCONS_00179042表达水平的方法优选的采用实时荧光定量PCR法。在本专利技术中所述实时荧光定量PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)荧光定量PCR试剂盒，并根据说明书配置体系和设定程序。所述lncRNATCONS_00179042的PCR上游引物序列优选的如SeqIDNo.3所示，下游引物优选的如SeqIDNo.4所示。在本专利技术中，所述siRNA通过敲低PAM细胞中TCONS_00179042的表达水平来抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。所述siRNA抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒具体的方法参见上述siRNA敲低PAM细胞中TCONS_00179042的表达水平的方法，先将siRNA转染PAM细胞，敲低TCONS_00179042的表达后，再用猪繁殖与呼吸综合征病毒感染PAM细胞，其他步骤与上述方法相同，在此不再赘述。在本专利技术中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后的PAM细胞的获取方法具体的为：将VR2332毒株接种于PAM细胞，接种毒株后加入含2％FBS的RPMI-1640培养基培养。在本专利技术中所述VR2332毒株为疫苗毒株，在本专利技术中所述VR2332毒株的MOI优选的为0.1。在本专利技术中，采用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF7的表达量。具体方法如下：收集细胞，用QiagenRNeasyMiniKit提取细胞总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR036A)反转录，然后用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF7的表达量，以GAPDH为内参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。2.权利要1所述的siRNA在敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述siR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婧，卢曾军，刘在新，孙普，曹轶梅，甘利鹏，李冬，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62