【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含腺伴随病毒构建体的靶向传导气道细胞组合物 关于联邦资助的研究或开发的声明本工作中部分是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助下进行(P01-HL051746)。美国政府可享有本专利技术的某些权利。专利技术背景腺伴随病毒(AAV)是细小病毒(Parvovirus)家族的成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4. 7千碱基(1Λ)到61Λ的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，所以AAV指定为依赖病毒属(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后整合入宿主基因组)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的AAV基因组随之得到解救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性，广泛的宿主感染范围，含有非分裂细胞和整合性的特点使AAV成为具有吸引力的输送载体。AAV衣壳含有三个病毒蛋白(VP)VPl、VP2和VP3的60个拷贝(总共)，预测比例为1 1 10，以T = 1排列的二十面对称体。[H-J Nam等，J Virol. ,81(22) 12260-12271 (2007年11月)]。这三个VP蛋白由同一 mRNA翻译，VPl除了 C末端含有完整VP2序列外，还包括独特的N末端结构域[Nam等，如前引用]。VP2除了其C末端的VP3外，还包括额外的N末端序列。在AAV2[Q. Xie等，Proc Natl. Acad. Sci. USA 99: 10405-10410(2002)]和 AAV4[L. Govindasamy 等，J. Virol. ,...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.04.30 US 61/174,149书中所用，术语“包括”和“含有”和其变体，包括“包含”、 “包容”和“含”等其他形式指包含其它的组分、元素、数值、步骤等。术语“由...组成”或 “组成为”则不包含其他的组分、元素、整数、步骤等。肺/传导气道靶向部分在一个实施方式中，本发明提供人工AAV衣壳，该衣壳是“空衣壳”，即包含无功能序列包装的衣壳。换言之，该衣壳缺少AAV病毒基因组和/或不含有表达框。在一个实施方式中，人工AAV衣壳没有功能性AAV序列包装。在另一个实施方式中，该AAV不含有功能性AAV基因编码序列且不含有内源或异源表达盒。“空的”AAV衣壳可用作异源分子的靶向蛋白。所需治疗或免疫原性或其他分子可通过“接头”序列的方法与本发明的人工AAV衣壳相关联。在一个实施方式中，该AAV衣壳和分子间的化学交联通过共价或非共价连接。然而正如本领域已知，也可采用其他亲和性结合配对。还可考虑本领域已知的其他偶联化学方法并用于本文的实施方式，包括但不限于活化聚乙二醇(PEG)，基于马来酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯的交联剂或SATA-SMCC双功能交联剂及本领域技术人员已知的其他连接。在另一个实施方式中，感兴趣的分子可通过PEG接头(‘间隔子’)与空AAV衣壳相连，如Destito 等，Chem Biol 2007 年 10 月；14(10) :1152-1162(2007)和 Oh 等，Bioconjug Chem 2006 ； 17 :721-727(2006)所述。在另一个实施方式中，如Chatterji 等，Bioconj Chem ；15 :807-813(2004)所述，通过化学修饰AAV表面赖氨酸残基(用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)或巯基基团(用马来酰亚胺和卤代乙酰胺试剂)来连接感兴趣的分子。在又一个实施方式中，修饰表面羧酸基团用于特异性连接。在另一个实施方式中，感兴趣的分子可通过免疫球蛋白分子的AAV结合结构域连接到AAV衣壳。在另一个实施方式中，该结合结构域可以是免疫球蛋白分子的Fab、Fab'、(Fab' )2或？￥片段。该结合结构域可通过任何已知的(包括上述的那些)方法连接感兴趣的分子。在一个实施方式中，PEG接头纳入结合结构域和感兴趣的分子之间。通过连接于接头序列来掺入DNA或氨基酸序列的这种构建技术在本领域已知，且属于蛋白质/遗传工程领域的常规技术。连接AAV衣壳并输送到靶细胞的有用分子可包括用于治疗疾病如囊性纤维化、 a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺动脉高压、哮喘、肺癌的分子。合适的分子例子包括基于非病毒的载体(如质粒、“裸露DNA”、粘粒等)，它们携带有表达基因产物的核酸。合适的基因产物例子包括下文所述与表达盒相关的产物。此外，基于其他非核酸的分子也可用于此实施方式中，包括例如类固醇、类固醇衍生物、免疫调节分子、酶、蛋白、小分子和其他化学部分。在另外的实施方式中，包括异源气道传导细胞靶向序列的人工AAV衣壳用于生产包装有表达盒并输送产物到靶细胞的载体。具有含传导气道靶向结构域的人工AAV衣壳的AAV载体在一方面，本发明提供了一种产生具有本发明新AAV衣壳的重组腺伴随病毒 (AAV)的方法。所述方法涉及培养宿主细胞，该宿主细胞含有如本文所定义的编码本发明新 AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成的表达盒；和足够的辅助功能因子以将表达盒包装进AAV衣壳蛋白。在宿主细胞内培养将AAV表达盒包装进AAV衣壳所必需的成分可以反式方式提供给宿主细胞。或者，通过用本领域技术人员已知的方法改造而含有一种或多种必需成分的稳定宿主细胞来提供一种或多种必需成分(例如表达盒、rep序列、cap序列和/或辅助功能因子)。更适当地，这种稳定的宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的所需成分。然而， 所需成分也可在组成型启动子的控制下。在关于适用于转基因的调节元件的讨论中，本文提供了适当诱导型和组成型启动子的实例。再或者，所选稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的选定成分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选定成分。例如可产生源自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的El辅助功能因子)的稳定宿主细胞，但其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员也可制备其他稳定的宿主细胞。产生本发明的rAAV所需的表达盒、rep序列、cap序列和辅助功能因子可以以转移所携带序列的任意遗传元件的形式输送至包装宿主细胞。所选遗传元件可通过任何适当的方法，包括本文所述的方法来输送。用于构建本发明任意实施方式的方法是核酸操作领域技术人员已知的且包括遗传工程、重组工程与合成技术。参见，例如Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法也是众所周知的，并且适当方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，K. Fisher 等，J. Virol.，70 :520-532 (1993)和美国专利号 5，478，745。除非另有说明，本文所述的AAV ITR与其他选定的AAV成分可容易地选自任何AAV,包括但不限于AAV2、AAV7、AAV9和其他AAV序列[如，W003/042397A1 ；WO 2005/033321 ；WO 2006/110689]。可使用本领域技术人员已知的技术容易地从AAV序列中分离这些ITR或其他AAV成分。所述AAV可分离获得或来自学术、商业或公开来源(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，玛纳萨斯，弗吉尼亚州)。或者，所述AAV序列可参考例如文献或数据库(例如GenBank 、PubMed 等)中的已公开序列通过合成或其他适当的方法获得。A.表达盒表达盒最小要由至少一个AAV反向末端重复序列、转基因和其调控序列组成。在一个实施方式中，5’ AAV反向末端重复(ITR)和3’ ITR都包括在表达盒中。在一个理想的实施方式中，所述表达盒含有的ITR来自除提供AAV衣壳蛋白序列以外的AAV序列。例如， 为方便起见，可采用含有AAV2ITR的假型载体。然而，也可选择其他适当来源的ITR。该表达盒被包装进衣壳蛋白并输送至选定的宿主细胞。1.转基因该转基因是编码感兴趣的多肽、肽、蛋白质、酶或其他产物，并与其侧连的载体序列异源的核酸序列。在一个实施方式中，所述表达盒携带核酸序列，如RNA。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、RNAi、核糖体RNA、催化性RNA、siRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个例子是抑制或消除靶核酸序列在经处理的动物中表达的序列。通常，合适的靶序列包括肿瘤靶标和病毒疾病。这在如癌症治疗和疫苗方面可能有所作用。所述核酸编码序列以允许转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达的方式操作性连接调节组分。虽然任何不同的产物都可用本发明的构建来输送，但本发明特别适合输送产物用于传导气道细胞相关病症的诊断、治疗和疫苗接种和其症状的改善。这些病症包括但不限于囊性纤维化、a-Ι-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺动脉高压。合适的基因产物可包括功能性的囊性纤维化跨膜调节子(CFTR)序列、a-Ι-抗胰蛋白酶、分泌白细胞蛋白酶抑制剂、表面活性蛋白C(SPC)、表面活性蛋白D(SPD)、免疫调节剂例如白介素如白介素-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素如干扰素-β和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。其他其他基因产物可包含癌症治疗剂，包括例如p53、FUSl、RNA(包括RNAi)等。本领域技术人员也可容易地选出其他合适的表达产物。2.调节元件除了如上鉴定的表达盒的主要元件以外，载体还包含常规控制元件，这些常规控制元件以允许转基因在本发明产生的质粒载体所转染或病毒所感染的细胞中转录、翻译和 /或表达的方式操作性地连接转基因。本文所用的“操作性相连”序列包括与感兴趣的基因毗连的表达控制序列和反式或在远端作用的表达控制序列以控制感兴趣基因。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化(PolyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列 (即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列是本领域已知并可利用的，其包括天然、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子。组成型启动子的例子包括但不限于逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选有CMV增强子)[参见例如， Boshart等，Cell，41 :521-530 (198 ]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β -肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFl启动子(Invitrogen)。诱导型启动子能11调节基因表达，并可通过外源提供的化合物，环境因素(例如温度)，或特定生理状态的存在(例如急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞中)来调节。诱导型启动子和可诱导系统可从多种商业来源获得，包括但不限于hvitrogen、Clontech和Ariad。已描述了许多其他系统且可由本领域技术人员方便选择。受外源补充化合物调节的诱导型启动子的例子包括锌诱导的羊金属硫蛋白(MT)启动子，地塞米松(Dex)-诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统[国际专利公开号WO 98/10088]，蜕皮素昆虫启动子[No等，Proc. Natl. Acad. Sci.美国，93 :3；346_3351 (1996)]，四环素阻抑系统[Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sci.美国，89 :5547-5551 (1992)]、四环素诱导系统 [Gossen 等，Science，268 :1766-1769 (1996)，也参见 Harvey 等，Curr. Opin. Chem. Biol.，2 512-518 (1998)]，RU486-诱导系统[Wang 等，Nat. Biotech. , 15 :239-243(1997)和 Wang 等， Gene Ther.，4 :432-441(1997)]和雷帕霉素诱导系统[Magari 等，J.Clin· Invest.，100 观56-2872(1997)]。可用于本发明的其他诱导型启动子类型由特定的生理状态如温度、急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞中调节。在另一个实施方式中，使用了转基因的天然启动子。当需要转基因的表达模拟天然表达时，可优选天然启动子。当转基因的表达必须按时间或按发育阶段、或以组织特异性方式或响应特定的转录刺激来调节时，可使用天然启动子。在另外的实施方案中，也可使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。转基因的另一实施方式包含操作性连接于组织特异性启动子的基因。例如，可使用肺组织特异性启动子和传导气道细胞特异性启动子(可获得时)。这些启动子的例子包括例如，叉头框Jl (FOXJl)启动子，聚泛素启动子WdC，包含SAM指向结构域的ETS转录因子 (SPDEF)启动子，克拉拉细胞分泌蛋白/子宫球蛋白(CCSP/UG)启动子等。其他肺特异基因启动子可包括例如，表面活性蛋白B(SPB)，表面活性蛋白C(SPC)，表面活性蛋白A(SPA)Jh 源人癌胚抗原(CEA)启动子，甲状腺转录因子I(TTFl)和人表面活性蛋白Al(hSPAl)等。任选地，携带有治疗用途的转基因的质粒还可含有选择性标记或报道基因，其包含编码抗遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素等的序列。这种选择性报道基因或标记基因(优选位于本发明方法解救的病毒基因组之外)可用来指示细菌细胞中质粒的存在，例如氨苄青霉素抗性。质粒的其他成分可包括复制起点。这些和其他启动子及载体元件的选择是常规的且很多这些序列是可获得的。为援引方便，转基因、启动子/增强子与AAV ITR的组合在本文中称为表达盒。根据本说明书的教导，这些表达盒的设计可通过采用常规技术制备。3.将表达盒输送至包装宿主细胞可用任何输送至包装宿主细胞的适当载体例如质粒来携带所述表达盒。用于本发明的质粒可改造成适合在原核细胞、哺乳动物细胞或这二种细胞中复制和任选地整合。这些质粒(或其他携带5' AAV ITR-异源分子-3' AAV ITR的载体)含有允许表达盒在真核细胞和/或原核细胞中复制的序列和用于这些系统的选择标记。选择性标记或报道基因可包括编码抗遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素等的序列。这些质粒还可含有某些选择性报道基因或标记基因以指示细菌细胞中载体的存在，例如氨苄青霉素抗性。质粒的其他成分可包括复制起点和扩增子，例如使用爱波斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒核抗原的扩增子系统。该扩增子系统或其他类似的扩增子成分允许细胞中高拷贝游离型复制。携带所述表达盒的分子优选转染入其可在之中暂时存在的细胞。或者，所述表达盒(携带5' AAV ITR-异源分子-3' AAV ITR)可稳定地整合进宿主细胞的基因组，或进入染色体或作为游离体存在。在某些实施方式中，所述表达盒可以多拷贝形式存在，任选地以头-对-头、头-对-尾或尾-对-尾的串联体形式。合适的转染技术是已知的，并可容易地用于将所述表达盒输送至宿主细胞。通常，当通过转染输送含有所述表达盒的载体时，将约5yg至约IOOyg DNA、约 10 μ g至约50 μ g DNA量的载体输送到约IX IO4至约IX IO13个细胞或约IX IO5个细胞中。 然而，考虑到诸如所选择的载体、输送方法和所选择的宿主细胞等因素，本领域普通技术人员可调整载体DNA与宿主细胞的相对量。B. Rep 与 Cap 序列除了所述表达盒以外，宿主细胞还含有在宿主细胞中驱动本发明的新AAV衣壳蛋白(或含有其片段的衣壳蛋白)表达的序列和与上述表达盒中发现的AAVITR相同来源或来自交叉互补来源的r印序列。AAV cap和r印序列可从前述AAV源独立地获得，并可以前述本领域人员已知的任何方式引入宿主细胞。此外，在假型化AAV载体时，编码各必需r印蛋白的序列可由不同的AAV来源提供(例如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、本文所述的或本领域已知的其他AAV序列之一)。例如，r印78/68序列来自AAV2，而r印52/40 序列来自AAV8。在一个实施方式中，宿主细胞稳定地含有在合适启动子(如前文所述)控制下的所述衣壳蛋白。在该实施方式中，所述衣壳蛋白最理想是在诱导型启动子的控制下表达。在另一个实施方式中，所述衣壳蛋白以反式方式提供给宿主细胞。当以反式输送至宿主细胞时，所述衣壳蛋白可通过含有指导宿主细胞中选定衣壳蛋白表达所需序列的质粒来输送。 当以反式输送至宿主细胞时，携带所述衣壳蛋白的质粒最理想还携带包装rAAV所需的其他序列，如所述rep序列。在另一个实施方式中，宿主细胞稳定地含有在合适启动子(如前文所述)控制下的所述rep序列。在该实施方式中，所述必需r印蛋白最理想是在诱导型启动子的控制下表达。在另一个实施方式中，所述rep蛋白以反式方式提供给宿主细胞。当以反式输送至宿主细胞时，所述rep蛋白可通过含有指导宿主细胞中选定rep蛋白表达所需序列的质粒来输送。因此，在一个实施方式中，所述I^p和cap序列可以在单一核酸分子上转染入宿主细胞，并且作为游离体稳定地存在于细胞中。在另一个实施方式中，所述rep和cap序列稳定地整合进细胞的染色体。在另一个实施方式中，所述rep和cap序列在宿主细胞中瞬时表达。例如，用于这种转染的有用核酸分子从5’到3’含有启动子、插在启动子与所述rep 基因序列起始位点之间任选的间隔子、AAVr印基因序列和AAV cap基因序列。任选地，所述r印和/或cap序列可提供在含有待引入宿主细胞的其他DNA序列的载体上。例如，该载体可包括含有所述表达盒的rAAV构建体。该载体可含有一个或多个编码辅助功能因子的基因，如腺病毒蛋白El、Eh和E4 0RF6基因与VAI RNA基因。用于该构建体的启动子优选本领域技术人员已知的或前文所述的任意组成型、诱导型或天然启动子。在一个实施方式中，使用AAV P5启动子序列。选择AAV来提供任何这些序列不构成对本发明的限制。在另一个优选的实施方式中，rep的启动子是诱导型启动子，例如前文所述与转基因调节元件相关。Rep表达的优选启动子之一是T7启动子。将含有T7启动子调节的rep基因和cap基因的所述载体转染或转化入组成型或诱导型表达T7聚合酶的细胞。参见1998 年3月12日公开的国际专利公开号WO 98/10088。在设计上述载体中，间隔子是可选元件。该间隔子是插在启动子和rep基因ATG起始位点间的DNA序列。该间隔子可具有任何所需的设计；即它可是随机的核苷酸序列，或者可编码基因产物，例如标记基因。该间隔子可含有通常包括起始/终止和PolyA位点的基因。该间隔子可以是来自原核生物或真核生物的非编码DNA序列、重复非编码序列、无转录控制的编码序列或有转录控制的编码序列。间隔子序列的两个示例来源是λ噬菌体梯序列或酵母梯序列，二者可购自例如Gibco或hvitrogen等。该间隔子大小可任意，只要足以降低r印78和r印68基因产物的表达，且r印52、rep40和cap基因产物的表达处于正常水平。因此，该间隔子的长度范围约为IObp-约ΙΟ.ΟΙΛρ，优选范围为约IOObp-约8. OlAp。 为减少重组的可能性，该间隔子长度优选小于21Λρ ；然而，本发明不限于此。虽然提供rep和cap的分子可能短暂(即通过转染)存在于宿主细胞中，但优选 rep和cap蛋白之一或二者与控制其表达的启动子在宿主细胞中稳定地表达，例如作为游离体或通过整合进宿主细胞染色体。用于构建本发明实施方式的方法是常规遗传工程或重组工程技术，如前文参考文献所述的技术。虽然本说明书提供了具体构建体的说明性实例， 但本领域技术人员可使用本文提供的信息来选择间隔子、P5启动子和其他元件(包括至少一个翻译起始和终止信号和任选加入的聚腺苷酸化位点)，从而可选择和设计其他合适的构建体。在本发明的另一个实施方式中，宿主细胞可稳定地提供上述I^p或cap蛋白。C.辅助因子功能为包装本发明的rAAV，包装宿主细胞还需要辅助因子功能。任选地，这些功能可由疱疹病毒提供。所需的辅助功能因子最理想分别由人或非人灵长类腺病毒源(如前文所述)提供，和/或可获得自各种来源(包括美国典型培养物保藏中心(ATCC)，玛纳萨斯，弗吉尼亚州(美国))。在一个目前优选的实施方式中，宿主细胞提供有和/或含有Ela基因产物、Elb基因产物、Eh基因产物和/或E4 0RF6基因产物。宿主细胞可含有其他腺病毒基因，例如VAI RNA,但这些基因不是必需的。在优选的实施方式中，宿主细胞中不存在其他腺病毒基因或基因功能。腺病毒Ela、Elb、Eh和/或E4 0RF6基因产物以及任何其他需要的辅助因子功能可采用任何使其在细胞中表达的方法提供。编码这些产物的序列可各自位于单独的载体上，或者一个或多个基因可位于同一载体上。所述载体可以是本领域已知的或前文所述的任何载体，包括质粒、粘粒和病毒。该载体可通过本领域已知或前文所述的任何方法引入宿主细胞，包括转染、感染、电穿孔、脂质体输送、膜融合技术、高速DNA-包被小球、病毒感染与原生质体融合等。一个或多个腺病毒基因可稳定地整合入宿主细胞基因组，作为附加体稳定表达，或者瞬时表达。基因产物可全部瞬时表达(在游离体上或稳定整合)，或者，一些基因产物可稳定地表达，而另一些瞬时表达。此外，各腺病毒基因的启动子可彼此独立地选自组成型启动子、诱导型启动子或天然腺病毒启动子。上述启动子可由生物体或细胞的特14定生理状态调节(即，分化状态或复制中或静息细胞)或由其他方法例如外源添加因子调节。D.宿主细胞和包装细胞系宿主细胞本身可选自任何生物体，包括原核细胞(如细菌)和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别理想的宿主细胞选自任何哺乳动物种类细胞，包括但不限于A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、C0S U COS 7、BSC U BSC 40、BMT 10, VERO、 W138、HeLa,293细胞(表达功能性腺病毒El)、Saos, C2C12、L细胞、HT1080、H印G2和来源于哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的初级成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。提供细胞的哺乳动物种类的选择和哺乳动物细胞类型的选择(即成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等)不限制本发明。对所使用细胞的要求是它不携带任何除El、Eh和/或E4 0RF6 以外的腺病毒基因；它不含有在rAAV产生过程中可导致污染病毒的同源重组的任何其他病毒基因；并且，它能被DNA感染或转染并表达所转染的DNA。在优选的实施方式中，宿主细胞是其中有rep和cap稳定转染的细胞。用于本发明的宿主细胞是用编码rep和cap的序列所稳定转化的，并用腺病毒E1、 Eh和E4 0RF6 DNA和携带有前述表达盒的构建体所转染的宿主细胞。也可类似地...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·L·贝尔，J·M·威尔森，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州立大学托管会，
类型：发明
国别省市：
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