本发明专利技术公开了一种能靶向治疗乳癌的人造油体载体、该载体的制备方法及应用。本发明专利技术利用pJO1-oleZH2质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后，经过诱导，进行oleZH2蛋白的生产，再将油和oleZH2蛋白混合，构建出人造油体载体。经由活体外（invitro）和活体内（invivo）实验确认本发明专利技术的人造油体载体可有效地运用于标靶治疗，而且包覆荧光物质的油体载体可反映HER2/neu阳性癌细胞，从而可专一性检测过度表达HER2/neu的乳癌细胞。本发明专利技术的制备过程简便且对环境造成的污染很低，人造油体载体在血球或血清中稳定性佳，还具有便宜、高效、操作方便、容积小和容易运输等优点。此人造油体载体能包覆各种不同油溶性抗乳癌药物，包覆药物后可有效杀死乳癌细胞，并可以对乳癌细胞进行专一性检测及标靶治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和医学生物学领域，涉及使用大肠杆菌表达oleZH2蛋白的 方法，人造油体载体的制备方法以及该载体在专一性侦测及标靶治疗乳癌中的应用。
技术介绍
癌症，亦称为恶性肿瘤，根据目前了解，其病因是由于癌细胞异常分裂且在体内各 处进行转移，导致生理功能异常且难以治愈，近年来成为全球人类死因之首。从2003年起， 乳癌已成为台湾女性中最常见的癌症，世界上50%的乳癌病患已诊断出HER2/neU阳性。这 些病患缺乏临床症状，且难以在早期发现。因此，迫切需求乳癌早期诊断工具。传统上治疗方法主要是利用外科手术方式将肿瘤切除，或是以化学药物或放射线 手段来杀死癌细胞。但是外科手术方式难以根除癌细胞而且不易实施，一般化学药物和放 射线治疗不具有专一性，在治疗过程中，往往会杀死维持一般生理功能所必须的正常细胞， 从而产生许多副作用，例如免疫功能下降(白血球数量下降)、恶心、呕吐、掉发、肠胃吸收功 能衰退及贫血等现象。经研究发现，癌细胞通常会带有某些特殊分子生物标记，近年来针对癌症治疗发 展出标靶治疗(targeting therapy)的方法。所谓标靶治疗，是设计一种可以专一性辨识癌 细胞表面分子生物标记的药物，可以有效阻断癌细胞活化或抑制其生长，从而达到治疗的 目的。标靶治疗药物可以直接精准地命中目标癌细胞，对于体内正常细胞的影响较小。因 此相对于传统治疗方法，标靶治疗具有低毒性、低副作用、高效率和实行方便等优点。标靶治疗有多种方式，如利用一载体包覆、连结或镶嵌一具有治疗活性的药 物分子，运用各种机制将该载体与药物分子专一性地递送到目标癌细胞，此种模式一般称 为药物传递系统(drug delivery system)。该载体具有标靶功能，该物质可以为蛋白质(例 如抗体)、类固醇、糖类或其它化合物等。目前已知载体有高分子聚合颗粒、微胞(micell)、微酯粒(liposome)及病 毒性载体等，这些载体各具不同缺点，例如粒径过大而不易被人体吸收、具有毒性、在血液 或体液中不稳定等，在实际运用上多有局限。此外，当此类型载体结合上述可辨识癌细胞的 物质时，通常需要复杂且耗时的化学合成步骤，不仅提高了制造成本，且会造成环境污染。 所以，迫切需求具有微小粒径、无毒性、稳定及易于结合辨识癌细胞的载体。针对上述需求，本专利技术利用分子生物技术，可提供一种人造油体载体，其制 备过程简便且对环境污染很低。经由活体外(in vitro)和活体内(in vivo)实验证明本发 明的油体载体可有效地运用于标靶治疗或侦测，且具优异的生物兼容性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种融合蛋白，其包含一油体蛋白、一配体性肽或一抗体性 肽、一细胞穿透性肽或前述组合。本专利技术的另一个目的是提供一种人造油体载体，其包含上述融合蛋白和一脂质，融合蛋白与脂质重量/体积比值(微克/微升)至少约1/25，该油体平均粒径为50纳米 至2000纳米。本专利技术的另一个目的是提供上述融合蛋白和人造油体载体的制备方法。本专利技术还有一个目的是提供一种可以靶向治疗乳癌的药物传递系统，其包含上述 人造油体载体及一药物、一讯号分子、或前述组合，能在活体外(in vitro)及活体内(in vivo)对乳癌进行专一性侦测及标靶治疗。本专利技术所述的一种能靶向治疗乳癌的人造油体载体的制备方法包括以下步骤(1)融合蛋白的表达。重组菌种BL21(DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培养，细菌初 始密度OD55tl值为0.08。接种到新鲜含有氨苄青霉素的LB培养液，当细菌密度OD55tl值为 0. 3时，37°C诱导4小时，收集菌体，以4000 rpm、4°C冷冻离心10 min，再用0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次，收集菌体，以 0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer 浓缩成细菌密度OD55tl值为10的菌液。将细菌密度OD55tl值为10的菌液用超声波细胞粉碎机进行冰上超声破碎(功 率3. 5%，时间2分钟，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)。超声结束后，以13000 rpm、4°C冷冻 离心10 min，收集离心后上清液和沉淀不水溶蛋白。(2)人造油体载体的制备。取IOOPg oleZH2蛋白，加入950μ1 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超声波细胞粉碎机进行冰上超声混合 (功率3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷冻离心 10 min, 取出上面一层白色的油饼，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超声波细 胞粉碎机打散，相同步骤进行三次，构建出人造油体载体。本专利技术所述的人造油体载体经过了各种性能测试，具有容积小、在血球或血清中 稳定性佳、低毒性、低副作用、高效、操作方便等优点。本专利技术所述的人造油体载体在活体外(in vitro)和活体内(in vivo)实验中都具 有靶向性，能专一性识别靶细胞，当包覆药物后，能抑制肿瘤生长。在体内抗肿瘤活性测试中，取约8-10周的裸鼠，用细胞株(SK0V3和MDA-MB-231) 进行皮下组织注射，使裸鼠皮下组织的肿瘤大小约0. 5厘米以上，每星期两次注射IOOmg/ ml包覆喜树碱的油体载体在肿瘤上，结果显示，随时间的增加，包覆喜树碱的油体载体能抑 制肿瘤生长，而且裸鼠体重没有减少。这说明本研究成功构建一种能靶向治疗乳癌的人造 油体载体。除非文中另有说明，于本说明书中所使用之“一”或“该”及类似用语应理解为包 含单数及复数形式。植物种子的油体具有相当大的表面积，可用于包覆或镶嵌大量的讯号分子， 以做为生物体内移动的实时(real time)讯号放大器来追踪并确认病灶，也可用于包覆脂 溶性药物，作为专一性药物传递系统来治疗疾病。本专利技术利用油体的上述特性，结合分子生 物技术，由简易制备方法来提供一种人造油体载体(下文简称为油体载体)。本专利技术的油体载体包含一融合蛋白及一脂质，其中，该融合蛋白包含一油体 蛋白、一配体性肽或一抗体性肽、一细胞穿透性肽或前述组合。本专利技术油体载体融合蛋白所含的油体蛋白并无任何限制。来自植物种子的油体蛋白较佳，例如芝麻油、橄榄油、大豆油、花生油和矿物油其组合，其中芝麻种子的油体蛋白更佳。本专利技术油体载体融合蛋白所含的配体性肽或抗体性肽，使油体载体成为专一性传 递载体(即标靶载体)。配体性肽或抗体性肽可精准地辨识癌细胞表面受体(rec印tor)，通 过配体性肽或抗体性肽与受体结合，可将包覆有抗癌药物的油体载体直接投递至癌变部位 或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，不影响正常细胞。此外，利用上述机制，也可刺激 癌细胞通过吞式作用(phagocytosis)与融合作用(fusion)吸收油体载体，使抗癌药物进 入癌细胞，从而达到治疗及避免产生抗药性的目的。本专利技术融合蛋白所包含配体胜肽或抗体胜肽并无任何限制，只要具有专一性 识别细胞的功能即可。就配体性肽而言，当治疗乳癌或卵巢癌时，可采用HER2/neU蛋白 质受体的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种靶向治疗乳癌的人造油体载体，其特征在于，所述人造油体载体包含一融合蛋白和一脂质，融合蛋白与脂质重量／体积比值（微克／微升）至少约１／２５，该油体平均粒径为５０纳米至２０００纳米。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱宝美，陈顺基，
申请(专利权)人：陈顺基，朱宝美，
类型：发明
国别省市：71
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