本发明专利技术属于基因工程药物领域。运用基因工程技术，本发明专利技术提供了一组人颗粒酶Ｂ蛋白衍生物ＧｒＢ－Ｇ４Ｓ－ＧｎＲＨ（ＧｒＢＬＧ）和ｍＧｒＢ－Ｇ４Ｓ－ＧｎＲＨ（ｍＧｒＢＬＧ）。二者为人成熟颗粒酶Ｂ（ＧｒＢ）与突变的人成熟颗粒酶Ｂ（ｍＧｒＢ）分别经柔性连接短肽ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（Ｇ４Ｓ）与人促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ）连接而成的靶向融合蛋白，均能通过配体人ＧｎＲＨ与细胞表面的人ＧｎＲＨ受体（ＧｎＲＨＲ）相结合。ｍＧｒＢ消除了原始ＧｒＢ通过自身“静电交换－吸附模式”结合并进入靶细胞的功能，同时保留了ＧｒＢ的酶促活性与杀细胞功能。本发明专利技术提供所述融合蛋白特异靶向杀伤ＧｎＲＨＲ阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据，展示了一组人颗粒酶Ｂ蛋白衍生物分别靶向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性的腺癌的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程药物领域。利用基因工程技术，本专利技术提供了一组人颗粒酶B蛋白衍生物GrB-G4S-GnRH (GrBLG)和mGrB-G4S-GnRH (mGrBLG)。 二者为人成熟颗粒酶B (GrB)与突变的人成熟颗粒酶B (mGrB)分别经柔性连 接短肽GlyGlyGlyGlySer (G4S)与人促性腺激素释放激素(GnRH)连接而成的 靶向融合蛋白，均能通过配体人GnRH与细胞表面的人GnRH受体(GnRHR) 相结合。mGrB消除了原始GrB通过自身静电交换-吸附模式(即通过GrB蛋 白特定阳离子序列中的碱性氨基酸结合细胞表面携带负电荷的粘多糖)结合并 进入耙细胞的功能，同时保留了 GrB的酶促活性与杀细胞功能。本专利技术提供所 述融合蛋白特异靶向杀伤GnRHR阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据，展示 了一组人颗粒酶B蛋白衍生物分别耙向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性 的腺癌的用途。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，近年来在全球范 围内呈增长趋势。加强恶性肿瘤防治研究已成为全球性的卫生战略问题。恶性肿 瘤的治疗长期以来是一项世界性难题，传统的手术、化疗和放疗的疗效总不尽人 意。近年来，利用受体与配体、抗体与抗原等分子间特异性相互结合等作用使药 物定向作用于特定细胞和组织的靶向治疗(targetedtherapy)研究日益受到关注。 癌症的耙向治疗研究是推动恶性肿瘤治疗和生物技术产业发展的前沿领域，肿瘤 靶向治疗药物是其中颇具前景的研究热点之一。靶向药物是利用化学方法或基因 重组技术将毒素或细胞因子与抗体、抗体可变区或有关配体相偶联而获得的融合 分子，具有针对性强、效果显著、较少伤及正常组织等优点。目前，靶向药物主 要指利用基因重组技术获得的重组靶向融合蛋白。靶向药物由靶向结合域和杀伤效应域组成。靶向结合域能够特异识别并结 合耙细胞，通常为肿瘤细胞表面特异抗原的抗体或高丰度受体的配体(如多肽激 素、细胞因子、小肽等)。杀伤效应域行使高效杀灭靶细胞的功能，多为源于动 物、植物、微生物的生物毒素或细胞因子。迄今，已有多种基于抑制肿瘤组织血 管生成、激活免疫细胞、以及利用毒素和细胞因子的细胞毒效应等途径设计的靶 向融合蛋白药物投入研制，并以其显著的体外抗肿瘤作用受到关注。然而，多种融合了人体外源毒素的靶向蛋白药物均无法成功应用于临床。用药后，机体在短 期内就会产生中和抗体，导致重复用药失效；严重时甚至出现免疫反应，以致休 克与死亡；同时伴随血管渗出综合征及肝、肾功能损伤等副作用。究其原因，主 要是该类药物的靶向准确性低以及严重的免疫原性和毒副作用等问题。这些也正 是靶向药物设计目前面临的主要问题。靶向性是靶向药物设计的核心，它直接决定了药物的特异性。特异性强的 药物具有高效、低毒、副作用小等优点。药物的靶向性与其靶向结合域直接相关。理想的靶向结合域应将药物准确定位于癌组织，以高亲和力特异性结合并进入肿 瘤细胞，不伤及或极少伤及正常细胞；此外，药物本身应无免疫原性。而杀伤效 应域本身与正常细胞的相互作用是决定药物靶向性的另一重要因素，在设计时需 全面考虑。免疫原性可能来自靶向药物的各个组分。早期多由人体异源蛋白、异 源毒素构成的杀伤效应域是药物免疫原性的主要来源。而毒副作用除了由杀伤效 应域决定外，也与药物的非特异性结合及免疫原性直接相关。可见，对靶向药物 进行准确靶向的人源化、智能化设计是保证其安全、有效的重要前提。结合癌症治疗的现状和靶向治疗的特点，本专利技术确立了一条研制基因工程靶 向融合蛋白药物以治疗一类恶性肿瘤的策略。本专利技术构建并表达包含毒性细胞因 子及配体多肽的融合蛋白，利用配体与靶细胞表面高丰度受体的特异性识别与结 合，将融合蛋白导入靶细胞，进而利用其中的毒性蛋白杀灭该细胞。该药物的靶 向结合域和杀伤效应域均选用源于人体自身的正常蛋白，从根本上消除了异源蛋 白带来的免疫原性问题，提高了药物的安全性。另一方面，利用分子生物学技术 对杀伤效应分子自身可与耙细胞静电结合的特定氨基酸序列进行改造，以消除其 与正常细胞通过该途径进行的非特异性结合，以达到显著降低融合蛋白毒副作用 的目的。各功能域间以柔性短肽相连接，保持了各自独立的空间构像，以保证其 各自正常的生物学活性；同时避免该融合蛋白被人体免疫系统错误识别，从而防 止免疫反应的发生。
技术实现思路
首先，本专利技术提供了一组人颗粒酶B蛋白衍生物GrB-G4S-GnRH (GrBLG) 和mGrB-G4S-GnRH (mGrBLG)。所述GrBLG是包含具有杀细胞功能的人成熟 GrB、柔性连接短肽G4S及具有GnRHR结合功能的人GnRH的靶向融合蛋白。 所述mGrBLG则是包含具有杀细胞功能的人突变成熟mGrB、G4S及人GnRH的 耙向融合蛋白。其中的mGrB在保留GrB原有酶促活性和杀细胞功能的前提下， 消除了其通过自身静电交换-吸附模式结合并进入细胞的功能。两种融合蛋白 GrBLG与mGrBLG均可通过GnRH耙向结合域特异性结合细胞表面的GnRHR，并经配体-受体相互作用进入表达GnRHR的细胞，进而利用杀伤效应域GrB和 mGrB杀灭该细胞。而mGrBLG消除了 GrB基团自身与细胞的静电结合，进而 消除了该融合蛋白通过该途径对正常细胞的非特异性杀伤作用。本专利技术提供所述 两种融合蛋白的融合编码基因05-G^-Gwi i/和mGW-G^-GW仏所述融合蛋 白编码基因的表达型重组体、所述表达型重组体的工程菌、及由此二工程菌分别 表达和纯化的融合蛋白GrB-G4S-GnRH和mGrB-G4S-GnRH。本专利技术同时提供所 述融合蛋白分别特异靶向杀伤GnRHR阳性细胞并毒副作用最小化的实验证据， 展示了一组人颗粒酶B蛋白衍生物靶向治疗一类促性腺激素释放激素受体阳性 腺癌的用途。优选地，所述融合蛋白GrBLG中的细胞杀伤效应基团是人成熟GrB蛋白， 其DNA编码序列如SEQ ID N0.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。优选地，所述融合蛋白mGrBLG中的细胞杀伤效应基团是经突变改造的人成 熟GrB蛋白mGrB。它是利用DNA重组技术对GrB自身原有结合靶细胞位点的 阳离子氨基酸编码序列进行替换突变，从而在不影响其酶促活性和细胞杀伤功能 的前提下，消除其通过自身静电交换吸附模式结合并进入细胞的功能。mGrB的 DNA编码序列如SEQ ID N0.8所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。优选地，所述GrBLG和mGrBLG中的靶向结合基团均为人GnRH蛋白，其 DNA编码序列如SEQ ID N0.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。更优选地，上述GrB和GnRH多肽经柔性短肽G4S相连，得到GrB-G4S-GnRH (GrBLG)融合蛋白，其DNA编码序列如SEQIDN0.4所示，对应的氨基酸序 列如SEQIDN0.7所示。更优选地，上述mGrB和GnRH多肽经柔性短肽G4S相连，得到 mGrB-G4S-GnRH (mGrBLG)融合蛋白，其DNA编码序列如SEQ ID N0.9所示， 对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.ll所示。附图说明图1. 基因RT-PCR扩增及/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组经基因工程改造的人颗粒酶Ｂ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ，ＧｒＢ）蛋白靶向衍生物ＧｒＢＬＧ和ｍＧｒＢＬＧ。
【技术特征摘要】
1.一组经基因工程改造的人颗粒酶B(Granzyme B，GrB)蛋白靶向衍生物GrBLG和mGrBLG。2. 如权利要求1所述的GrBLG，其特征为人成熟颗粒酶B与人促性 腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH)经短 肽G4S连接而成的融合蛋白GrB~G4S^GnRH。3. 如权利要求1和2所述的融合蛋白GrBLG，在其融合编码基因中，05基因的DNA编码序列如SEQ ID NO. 1所示，Gwi // 基因的DNA编码序列如SEQ ID NO.2所示，基因的DNA编 码序列如SEQ ID NO.3所示，上述三片段重组而成的融合蛋白 GrBLG的融合编码基因的DNA编码序列如SEQ ID NO.4 所示。4. 如权利要求1和2所述的GrBLG，其中，GrB的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，GnRH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，G4S 的氨基酸序列即GlyGlyGlyGlySer，上述三片段重组而成的融合蛋 白GrBLG的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。5. 如权利要求1和2所述的GrBLG,其融合基因的酵母真核表达型 重组体为z^/0^-O^ZG，如图6所示；其大肠杆菌原核表达型 重组体为；^T3^-G^丄G，如图11所示。6. 如权利要求1和2所述的GrBLG，其真核表达蛋白的基因工程菌 是将/ 尸/C9《-05丄G转化入巴斯德-毕赤酵母(尸/c/z/a paeon's) GS115获得的GS115/p尸/C9OB丄G,其原核表达蛋白的基因工程菌是将/^rWa-OSZG转化入大肠杆菌Origami获得 的Origam一rHB丄G。7. 如权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢圣栋，李一叶，李涛，陈伟京，路金芝，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。