一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白多聚体纳米疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白亚单位纳米疫苗。本发明专利技术以新型冠状病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)表达蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(HP_Ferritin，HPF)的N端通过SpyTag/SpyCatcher(ST‑SC)系统中分子间异肽键作用连接组成亚单位多聚体蛋白，实现抗原多聚化；或将RBD表达蛋白与七肽重复区(Heptad Repeat,HR)表达蛋白，共同与HPF蛋白以ST‑SC共价结合组成双亚单位多聚体蛋白，实现抗原多聚化。该方案可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。同时基于序列分析，本发明专利技术的方案有望研发出针对多种冠状病毒有效的疫苗。而且本发明专利技术疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。

【技术实现步骤摘要】
一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白多聚体纳米疫苗
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种基于幽门螺旋杆菌铁蛋白的新型冠状病毒(SARS-CoV-2，又名2019-nCoV)S蛋白双区域亚单位纳米疫苗。
技术介绍
由于目前新型冠状病毒肺炎的病毒来源、发病机制等尚不明确，并且缺乏特效抗病毒药物，为临床诊治和控制疫情带来极大困难，造成严重的社会负担和危机。目前，人类仍缺乏有效的抗SARS-CoV-2的疫苗，在这种严峻的形势下，尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群，对于人民健康与国家安全具有重要意义。因此，目前针对冠状病毒，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2，开展高免疫原性和中和效率的疫苗的研发工作迫在眉睫。对于冠状病毒疫苗的研发，在前期的研究中，来源于MERS-CoV以及SARS-CoV的RBD单体疫苗接种动物模型后仅能引发较低的假病毒中和抗体水平。中国专利2020101440324(公开号CN111217919A)提供了一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白双区域亚单位纳米疫苗，方案中将病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)和融合肽(Fusionpeptide,FP)共同作为双抗原，并与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcusfuriosus_Ferritin,Ferritin(PF))融合组成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin后作为抗原，提高了抗原免疫原性，所制得的疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。同时，我们对更多、更优的疫苗制备方案进行不断地探索研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有新型冠状病毒治疗药物以及疫苗的不足，为尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群。本专利技术以病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)单独或者与七肽重复序列(HeptadRepeat,HR)共同作为双抗原片段，并与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)通过ST-SC共价作用实现抗原的多聚化，构建开发了抗原多聚体复合物。此方案具体是：以病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)加上ST标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-ST-RBD蛋白。以七肽重复序列(HeptadRepeat,HR)加上ST标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-ST-HR蛋白。以幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)加上SC标签、信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F或者CHO细胞)表达，经纯化获得His-tag-SC-HPF蛋白。His-tag-SC-HPF蛋白可自行组装成球状二十四聚体纳米颗粒。将自组装成二十四聚体纳米颗粒的His-tag-SC-HPF蛋白与His-tag-ST-RBD蛋白共同孵育，则通过ST-SC共价键的作用形成RBD-HPF亚单位二十四聚体蛋白。将自组装成二十四聚体纳米颗粒的His-tag-SC-HPF蛋白与His-tag-ST-RBD蛋白以及His-tag-ST-HR蛋白共同孵育，则通过ST-SC共价键作用形成RBD-HR-HPF双亚单位二十四聚体蛋白。这种二十四聚体蛋白可将RBD蛋白单独或者RBD/HR蛋白共同展示在纳米颗粒表面，克服了RBD单体免疫原性不足的缺点，能够有效地引起更强的免疫反应，产生中和SARS-CoV-2病毒入侵靶细胞的抗体。本专利技术的方案所制得的疫苗能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平；而且本专利技术疫苗制备方法简单、蛋白含有His标签易于纯化，NIH登记的临床试验中已证明了Ferritin抗原作为纳米疫苗载体的安全性，疫苗可较快的应用于临床试验。因此，本专利技术第一目的是提供一种提高抗原免疫原性的方法。本专利技术另一目的是提供一种基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD亚单位或者RBD-HR双亚单位与细菌多聚物构建的二十四聚体化的亚单位的新型冠状病毒抗原。本专利技术另一目的是提供所述新型冠状病毒抗原在制备新型冠状病毒疫苗及抗新型冠状病毒药物中的应用。本专利技术再一目的是提供所述新型冠状病毒抗原的制备方法。本专利技术再一目的是提供编码表达所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列、载体或转基因细胞系。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供一种提高抗原免疫原性的方法，是将冠状病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)进行表达，所得蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。或，所述提高抗原免疫原性的方法是分别将冠状病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)与七肽重复区(HeptadRepeat,HR)进行表达，所得蛋白再共同与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。具体操作方案中，所述方法是将病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)和ST标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-ST-RBD蛋白；将七肽重复序列(HeptadRepeat,HR)和ST标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-ST-HR蛋白；将幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)和SC标签、信号肽、标签链接，经过融合后形成SP-His-tag-SC-HPF蛋白。本专利技术提供的含有标签SC的蛋白可与含有ST标签的蛋白通过共价作用结合。进一步优选地，所述方法构建的SP-His-tag-ST-RBD蛋白与SP-His-tag-SC-HPF蛋白共同孵育，组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。或，所述方法构建的SP-His-tag-ST-RBD蛋白与SP-His-tag-ST-HR蛋白以一定的比例混合后再与SP-His-tag-SC-HPF蛋白共同孵育，组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。上述方案中，铁蛋白(Ferritin)作为一种可自组装的球形蛋白，其表面每相邻两个亚单位的氨基端间距约为4.5-7.5nm，适合在外表面负载抗原。利用HPF这样一种来源于幽门螺旋杆菌的铁蛋白能够自发形成多聚化的特性，且表面负载抗原后能诱发很强的体液免疫反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高抗原免疫原性的方法，其特征在于，所述方法是将新型冠状病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)进行表达，所得蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高抗原免疫原性的方法，其特征在于，所述方法是将新型冠状病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)进行表达，所得蛋白与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HPF亚单位多聚体蛋白后作为抗原。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，RBD先与ST标签连接后进行蛋白表达，ST的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；SEQIDNO:2与SEQIDNO:1直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白ST-RBD。


3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时所得融和蛋白ST-RBD的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。


4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，分别将新型冠状病毒的受体结合域(Receptorbindingdomain,RBD)与七肽重复区(HeptadRepeat,HR)进行表达，所得蛋白再共同与幽门螺旋杆菌多聚物蛋白(Helicobacterpylori_Ferritin,HPF)通过共价结合的方式组成一个新的RBD-HR-HPF双亚单位多聚体蛋白后作为抗原。


5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，新型冠状病毒SARS-CoV-2的HR的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，HR先与ST标签连接后进行蛋白表达，ST的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；SEQIDNO:2与SEQIDNO:4直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白ST-HR。


6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时所得融和蛋白ST-HR的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。


7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，幽门螺旋杆菌多聚物蛋白HPF的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，HPF先与SC标签连接后进行蛋白表达，SC的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；SEQIDNO:7与SEQIDNO:6直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白SC-HPF。


8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，邹帆，
申请(专利权)人：广州千扬生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44