靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用制造技术

本发明专利技术公开一种靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用，具体的公开1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；一种CAR及其构建体结构、构建体的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组表达载体，并公开了相应表达载体的构建方式及其应用。本发明专利技术CAR结构赋予了T细胞更强和持久的增殖能力以及更强的抗肿瘤能力；本发明专利技术可以避免多次输注单靶点的CAR‑T细胞，不但减轻了对患者的伤害，也可以减轻其经济压力，具有较大的临床研究及应用价值。

【技术实现步骤摘要】
靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用
本专利技术涉及肿瘤生物免疫治疗领域，涉及一种双特异性嵌合抗原受体(CAR)。具体的，涉及一种同时靶向人CD123和人NKG2DL的、包含抗人CD123scFv和人NKG2D胞外段或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体(CAR)、重组表达载体、该CAR修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为表达能识别特定的肿瘤表面抗原的抗原结合域，使T细胞获得抗体的特异识别肿瘤的能力，并通过CAR的胞内段信号区激活T细胞，使CAR-T细胞释放细胞因子、增殖并发挥细胞毒作用，靶向清除恶性肿瘤细胞。临床研究证实这类工程化的T细胞能够在体内扩增，长期存活并形成免疫记忆，对难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。目前CAR-T在治疗急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤中已经取得显著成绩，特别是以CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗。但在实体瘤以及髓系恶性肿瘤的治疗中仍然面临巨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；/n其中所述抗CD123单链抗体(抗CD123scFv)的结构是针对包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面抗原CD123设计的特异性抗原结合域，可特异性与括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面CD123结合；/n所述抗CD123scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，VH和VL间通过至少一个接头(linker)连接，其排列方式可为VH—linker—VL或VL—li...

【技术特征摘要】
1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；
其中所述抗CD123单链抗体(抗CD123scFv)的结构是针对包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面抗原CD123设计的特异性抗原结合域，可特异性与括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面CD123结合；
所述抗CD123scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，VH和VL间通过至少一个接头(linker)连接，其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH；
所述天然NKG2D胞外段主要表达于NK细胞，NKT细胞，CD8+αβT及部分γδT细胞的膜表面，可与表达于包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面的NKG2D配体(NKG2DL)相结合。


2.如权利要求1所述双特异性CAR的并联连接方式为：
1)可切割的结构域；
2)第一CAR，所述第一CAR包含(从羧基端到氨基端)：
第一信号肽结构域；
第一抗原结合结构域；
第一跨膜结构域；
第一共刺激信号结构域；和
第一胞内信号传导结构域；
3)第二CAR，所述第二CAR包含(从羧基端到氨基端)：
第二信号肽结构域；
第二抗原结合结构域；
第二跨膜结构域；
第二共刺激信号结构域；和
第二胞内信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接；
所述两个抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段。


3.如权利要求1所述双特异性CAR的串联连接方式为(从羧基端到氨基端)：
信号肽结构域；第一抗原结合结构域；第二抗原结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号结构域；胞内信号传导结构域；
所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段；所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过linker连接而成。


4.如权利要求1-3中所述的CAR，
其中抗CD123scFv包含：含有SEQIDNO：1的氨基酸序列；
其中NKG2D胞外段包含：含有SEQIDNO：2的氨基酸序列。


5.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述信号肽结构域包括但不限于人CD8α信号肽、人IL-2信号肽、人GM-CSF信号肽、人胰岛素信号肽、人胰蛋白酶原信号肽。
所述人CD8α信号肽氨基酸序列包含SEQIDNO：3的氨基酸序列。所述人IL-2信号肽包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。


6.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述跨膜结构域与所述抗原结合域之间可直接连接或由铰链结构域连接；
跨膜结构域包括但不限于人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区；
所述铰链结构域包括但不限于人CD8α铰链区、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明峰，金鑫，曹雅青，
申请(专利权)人：金鑫，
类型：发明
国别省市：天津;12