一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种血管生成抑制剂及其制备方法，属于基因工程制药领域，具体涉及一种能够作为血管生成抑制剂的融合蛋白。该融合蛋白具有长效的抑制血管生成作用，本发明专利技术公开的技术方案一方面提高了血管生成内皮抑素的抗血管生成活性及对黑色素瘤的抑制效果，另一方面又延长其半衰期，进一步增强了稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗血管生成活性的药物及其制备方法
本专利技术属于生物技术制药领域，更具体的说，涉及一种具有抑制血管生成活性的融合蛋白，可应用在抗肿瘤药物领域中。
技术介绍
据2018年全国最新研究报告，我国恶性肿瘤新发病例数高达380.4万例，全国癌症死亡人数达229.6万例，因此恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，与心脑血管疾病和意外事故构成当今世界所有国家三大死亡原因。随着社会经济的不断发展，肿瘤的患病率逐年上升，因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。目前治疗肿瘤的手段包括物理治疗(放射疗法，手术摘除)和化学治疗(抗肿瘤药物)，前者对患者机体的损伤较大，后者多数患者会出现严重的副作用，包括恶心，呕吐，掉发等，且患者容易出现抗药性。以上方法皆不能完全根治肿瘤，因为肿瘤细胞往往具有浸润性和转移性，为治疗带来困难。原发肿瘤的生长与转移是依赖于新生血管完成的，肿瘤的血管既能够为肿瘤的生长提供营养，又能通过血管介导肿瘤细胞转移，在肿瘤的整个生长阶段占有很重要的地位，若能够抑制肿瘤新生血管的形成，既能够阻断肿瘤细胞的营养供给渠道，又能阻断肿瘤细胞的转移渠道，解决了因肿瘤具有转移性而难以治疗的缺点，因此针对肿瘤血管生成的疗法近几年来备受重视，展现出了良好的应用前景。有研究发现，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢，而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速，说明肿瘤血管的数量与肿瘤的发展程度息息相关。新生血管的形成主要依赖于血管内皮细胞的增殖，迁移和管腔的形成，这是新生血管发生的主要过程，是机体内促血管形成因子和抑制血管形成因子互相协调的结果。肿瘤新生血管发生的具体过程如下：①肿瘤细胞释放促血管形成因子(例如VEGF，bFGF等)，激活血管内皮细胞上的促血管形成因子受体，活化内皮细胞，增加血管通透性；②活化的内皮细胞释放蛋白酶，降解基底膜；③内皮细胞发生增殖和迁移，形成周围基质及萌芽状机构；④芽状机构进一步扩大呈环形，最终形成血管腔；⑤血管腔成熟并稳定，形成新的血管分支。整个血管形成过程是高度有序的。根据肿瘤新生血管形成过程，1971年，JudahFolkman首次提出血管生成对于肿瘤生长和转移的重要性，至今为止，“肿瘤血管生成理论”不断被证实并丰富，研究发现，肿瘤的生长需要大量氧气和养料，为肿瘤细胞提供这些养分的渠道就是血管，并且肿瘤血管能够将肿瘤细胞的有害代谢物质运出，刺激肿瘤生长，当肿瘤生长到一定阶段，会通过与此相连的血管进行转移，根据此过程，“抗血管生成理论”被提出，即通过抑制血管生成从而抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤的侵袭转移是肿瘤治疗的难点，而抑制肿瘤血管生成能够有效抑制肿瘤生长所需养分的运输以及转移渠道，所以将肿瘤新生血管作为治疗的靶点来达到抑制肿瘤的方式是目前研究的主要方向。目前抑制肿瘤血管生成的药物有很多，包括抑制基底膜降解的药物，抑制内皮细胞的药物(直接抑制内皮细胞的药物和抑制血管内皮细胞上的特异性整合素的药物)，针对血管生长因子的药物。抑制内皮细胞的药物包括2种，一是直接抑制内皮细胞的生长，如内皮抑素；二是抑制内皮细胞上的特异性整合素的药物，该药物能够作用于整合素的不同配基，阻碍整合素开启的后续通路，抑制内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管形成。目前开发最多的是以促血管生长因子为靶点的药物，该药物能够抑制血管生长因子受体信号，阻断后续信号通路的开启和血管生长因子的分泌，从而达到抑制肿瘤的目的，目前以VEGF及其受体为靶点的药物发展最快，如贝伐单抗，恩度等，但因为肿瘤血管的生成是多种因子协调的结果，其形成的步骤较复杂，涉及许多因子和信号通路，因此单一靶点的药物并不能完全抑制肿瘤的生长和转移，在临床中往往达不到预期的效果，所以多靶点，多途径抑制血管生成成为人们研究的方向之一。抑制肿瘤新生血管生成的药物较传统抗癌药物相比有以下优点：①实体瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管，因此以血管生成为靶向的药物具有广谱性，能够针对多种实体瘤发挥作用；②部分抑制肿瘤新生血管生成的药物作用于内皮细胞，内皮细胞与癌细胞相比具有突变率低的优点，机体产生抗药性的概率低；③药物可通过血液运输，直接达到靶位点，起效时间快，毒副作用少。在血管生成过程中，血管内皮细胞粘附分子是一种重要的物质，能够将多种细胞成分粘附在一起，加速新生血管的发生与稳定。其中整合素家族属于血管内皮细胞粘附分子的一种，是跨膜蛋白，能够介导细胞与细胞外基质的粘附，在肿瘤血管新生和肿瘤转移的过程中发挥着重要作用。整合素是由α和β两种亚基组成的，目前共报道了18种α亚基和8种β亚基，不同亚基能够组成24种不同的整合素。整合素调控细胞的双向信号通路，能够识别胞外的配基并与之结合，打开胞内信号通路，介导内皮细胞和肿瘤细胞的粘附和迁移，例如整合素能够参与MAPK信号通路，调控VEGF的表达，促进VEGF与其受体的结合。目前αvβ3和αvβ5是研究较多的两种整合素，关于这两种整合素参与肿瘤恶化的报道很多，一方面整合素能够调控肿瘤细胞表达基质金属蛋白酶，加速胞外基质的降解，促进新生血管发生，一方面能够促进肿瘤自身分泌粘附分子，肿瘤细胞可通过粘附分子进行扩散，实现肿瘤细胞的转移。因此整合素在肿瘤血管生成和肿瘤细胞的生长和转移中发挥着重要作用，整合素也成为治疗肿瘤的重要靶点之一。αvβ3在多种细胞中得到表达，但只在新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面存在高表达，而在静止的内皮细胞和正常的细胞表面低表达，因此，整合素αvβ3可作为抗血管生成较重要的靶点。αvβ3能够识别配体中Arg-Gly-Asp(RGD)序列，因此RGD在体内可以作为靶向整合素的靶向肽。但RGD序列仅有3个氨基酸构成，若单独存在极易被体内的蛋白酶降解。ZL2005100403785介绍了一种融合肽HM-3，为整合素阻断剂，氨基酸序列为：Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。HM-3由2部分组成，内皮抑素活性肽ED(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)和整合素配体序列(Arg-Gly-Asp)，两者之间由linker(Gly-Gly-Gly-Gly)进行连接，结构式为ED-L-RGD和RGD-L-ED。内皮抑素活性肽ED是内皮抑素的第60-70个氨基酸片段，有研究发现该片段在体外具有抑制血管生成的活性，但体内活性较低，可能与小肽的半衰期较短相关；HM-3将两种序列结合，研究发现该融合小肽具有很好的抗血管新生的效果，既保留了ED的抗血管生成活性，又能发挥RGD的靶向作用。研究证明，HM-3的作用靶点为αvβ3和α5β1，主要以αvβ3为主，体内体外实验皆证明该小肽能够有效抑制血管内皮细胞的迁移和粘附，抑制肿瘤血管的生成，具有较好的抑瘤效果。目前，HM-3在我国已开始临床实验(登记号：CTR20150368)，拟用临床用药是每天进行静脉滴注。每天注射给药不仅给病患带来巨大的痛苦，也增加了治疗成本，原因是HM-3属于短肽，半衰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
20190527 CN 20191044598661.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备。


3.根据权利要求2所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)。


4.一种如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
①全基因合成融合蛋白的DNA序列；
②通过基因工程技术连接目的片段与载体，获得含编码所述融合蛋白的DNA序列的重组酵母表达载体；
③将步骤②所述的重组酵母表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，李婷，支德娟，李洋，王欣，史彦斌，马兴铭，朱红梅，王梅竹，刘燕，段建功，张涵姿，葛广飞，赵陇和，岳昭蓉，何玉红，刘怡瑶，宋美娟，谢飞，王如玥，谢亲建，宋鹏，裴月娟，海洋，王宁波，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62