一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2。本发明专利技术还公开了所述蛋白的核酸分子，以及所述核酸分子的重组载体、宿主细胞或重组菌。还公开了所述蛋白以及所述核酸分子及其重组载体、宿主细胞或重组菌等在调控植物抗虫性、杀虫或提高转基因植物抗虫性和制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟更高的杀虫活性，且对Cry1Ab、Cry1F、Cry1Ie毒蛋白抗性玉米螟种群有显著的杀虫效果。本发明专利技术利用组成型启动子构建了新的植物表达载体，抗虫基因mCry1Ia2能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。

【技术实现步骤摘要】
一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用。
技术介绍
Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，其广泛存在于水、土壤、沙漠、树叶、昆虫尸体中，是现今产量最大、使用最广的生物杀虫剂。它在形成孢子时可以形成杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，又称δ-内毒素，可以对鳞翅目和鞘翅目等农业害虫产生特异性的杀虫活性。其作用过程包括昆虫体吞食原毒素、原毒素酶解与活化、毒素穿过围食膜、毒素与特定受体结合、毒素分子嵌入表皮细胞膜、形成离子通道、中肠细胞的离子失衡后细胞裂解。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。Whiteley和Schnepf于1985年发表了从苏云金芽孢杆菌中克隆得到的cry基因核苷酸序列。随着不断发现新的Bt菌株以及Bt基因的克隆，Bt家族的成员不断增多，根据数据库(www.lifesci.sussex.ac.uk)最新更新数据统计，目前在分离得到的Bt菌株中已经识别并且命名了975个杀虫蛋白基因，包括789个Cry基因，38个Cyt基因以及142个Vip基因。通过将Bt基因导入植物中来培育抗虫转基因作物，是Bt基因的主要应用方向。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的数据统计发现，通过安全评价Bt基因的转化事件共有345个，其中玉米转化体事件通过审批的有255个。孟山都和迪卡公司于1990年获得了结实正常的转Bt基因玉米。1993年，Koziel等研发出转cry1Ab基因玉米，Michael等通过改造cry1Ab基因获得的转基因玉米株系对玉米螟具有较高抗性。1996年，美国开始商业化种植转基因抗虫玉米。1997年，美国正式批准了4个转Bt基因玉米品种可进行销售，包括由孟山都公司推出mon810，Syngenta公司推出的bt176、bt11，以及迪卡公司的DBT418，其防治对象均为玉米螟，该年抗虫转基因玉米的种植面积达到320万hm2。地老虎、玉米根叶甲等地下害虫同样影响玉米产量，因此孟山都公司推广防治地下害虫“mon863”(cry3Bb)，并获得了可以同时对玉米螟和地下害虫有防治效果的抗虫玉米“mon863×mon810”。2007和2008年，先正达公司推出了防治鳞翅目害虫和地下害虫的mir604(cry3A)和mir162(Vip3Aa)。又分别在2011年和2012年推出了双基因的“bt11×GA21×mir162”和三基因的“bt11×mir162×mir604×GA21”抗虫玉米。我国对于抗虫转基因玉米的研究起步较晚，但近年来取得很大进展，获得了多个遗传稳定且抗虫性状比较好的转化体及转基因杂交组合。王国英等(1995年)采用基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中并获得转基因植株，鉴定后发现其具有一定抗虫性。张莉萍等(2003年)将改造的Bt、SCK、SCK与Bt双价抗虫基因通过基因枪法转入玉米自交系R18中，获得了大量转基因植株。张艳贞等(2004年)采用农杆菌介导法将Bt基因导入玉米自交系4112和丹340中，通过分子检测方法，证明外源基因在玉米基因组上已稳定整合，平均转化率达到2.35％。李余良等(2005年)在玉米自交系S1中转入Bt和GNA基因，获得能够同时扩增出两个目的基因的株系，进行室内抗虫鉴定发现其表现较强的抗性。谢树章等(2015年)通过密码子优化的方法获得GmCry1F基因，并转入到玉米材料中，为抗虫品种培育提供了新材料。王阳等(2016年)将Cry1Ab的结构域与Cry1Ial结构域互换后进行密码子优化并转入玉米中，获得了遗传稳定的抗玉米螟新种质。中国农业大学利用自主产权的抗虫基因mCry1Ac培育出优良转化体Bt-799，田间心叶期接虫条件下转基因抗虫玉米Bt-799表现高抗亚洲玉米螟。2019年12月，北京大北农生物技术有限公司转Cry1Ab基因的DBN9936抗虫玉米，以及杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学转cry1Ab/cry2Aj的双抗12-5玉米分别获得安全证书审批。转基因作物中应用最多的是Cry1Ab，是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景。苏云金杆菌δ-内毒素基因Cry1Ab来源于微生物，但其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题。通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的(Koziel，1993)。靶标害虫产生抗性将严重阻碍Bt制剂及转Bt基因抗虫玉米的持续应用，大面积种植单一转基因抗虫植物，可能引起靶标害虫产生抗性。目前的研究发现，许多昆虫在室内已经对Bt毒蛋白产生不同程度的抗性，田间或温室条件下也有对Bt制剂或Bt作物产生抗性的报道。农药交互抗性是指植物害虫或病原微生物对一种杀虫(菌)剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过但作用机制相似的药剂也产生了抗药性的现象。目前的研究也发现，许多农药在应用时都会产生交互抗性，所以克服交互抗性的问题也是目前各种作物抗病虫研究中的重要课题。一般认为Bt蛋白的结构域Ⅰ参与孔道的形成，结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合，结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。室内研究表明，亚洲玉米螟Cry1F抗性品系对Cry1Ab和Cry1Ac杀虫蛋白有中等的交互抗性，但与Cry1h或Cry1Ie没有交互抗性，将Cry1F与Cry1h或Cry1Ie进行叠加，可以作为延缓亚洲玉米螟对Bt蛋白产生抗性的策略(Wangetal.,2016)。进一步的研究表明，Cry1Ie与Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry1h没有交互抗性，可以与这些蛋白进行叠加，延缓Bt蛋白产生抗性(Wangetal.,2017)。玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。单一的抗虫基因使用又往往会使玉米螟对Bt蛋白产生抗性。因此，应用新的抗虫基因组合、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型抗虫转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。
技术实现思路
为了培育新型抗虫作物，本专利技术的目的在于提供一种人工合成抗虫蛋白mCry1Ia2。本专利技术的另一个目的是提供编码上述蛋白的核酸分子。本专利技术的另一个目的是提供含有上述基因的重组载体、宿主细胞或重组菌。本专利技术的另一个目的是提供上述蛋白在调控植物抗虫性、杀虫或提高转基因植物抗虫性中的应用。本专利技术的进一步目的是提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：/n(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；/n(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；/n(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；/n(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。/n

【技术特征摘要】
20200116 CN 20201004685531.一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：
(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；
(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；
(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。


2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。


3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下1)-4)中任一所述核酸分子：
1)编码区包括序列表中序列1所示的核酸分子；
2)编码区由序列表中序列1所示的核酸分子组成；
3)与1)或2)限定的核酸序列杂交且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子；
4)与1)或2)限定的核酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子。


4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是通过将密码子优化后的Cry1Ab的第一、第二功能结构域1392bp和Cry1F的第三功能结构域453bp和Cry1Ie一个长2157bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：于壮，岳莉莉，
申请(专利权)人：黑龙江大鹏农业有限公司，于壮，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23