核盘菌抗多菌灵检测基因及其检测方法技术

本发明专利技术是核盘菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）抗多菌灵的检测基因及其检测方法，专用于抗苯并咪唑类杀菌剂的核盘菌的检测。在国际上首次报道与抗多菌灵相关的核盘菌的β－微管蛋白基因，全长１６８５个核苷酸，包含需检测的抗药性突变位点。直接从田间采集回来的菌核中提取基因组ＤＮＡ到ＡＳＯ－ＰＣＲ整个检测过程只需６ｈ，检测准确率达９６％以上，达到对抗多菌灵的核盘菌的快速、简便、准确、灵敏的检测。图为：从菌核中直接提取的基因组ＤＮＡ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)抗多菌灵的检测基因及其检测方法，属于植物病原菌生理小种的检测方法，专用于检测抗多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的核盘菌。二、技术背景油菜菌核病是由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary引起的一种世界性病害，严重影响油菜的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用2～3年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。本专利专利技术人研究证明油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性产生是因为细胞中β-微管蛋白基因发生突变，使编码的蛋白质三维构象改变，从而失去了与药剂分子的亲和性。近年研究证明，β-微管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。早期检测病原群体中抗药性生理小种/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理策略，是延缓抗药性生理小种的发展，防止抗药性病害流行危害最有效的措施。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，难以早期发现抗药性生理小种的存在，也不能用于当年的抗药性短期预测。在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变的原理，应用核酸技术如ASO-PCR技术等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测大量样本，使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。作者已研究应用PCR技术检测抗多菌灵的核盘菌，包括前期的分离培养、收集菌丝再提取基因组DNA、PCR扩增的过程，某一样品若用S-TR引物能扩增出373bp的条带，而S-TS引物扩增后无条带出现时，该样品可确定为抗药性菌株；若用S-TS引物能扩增出373bp的产物，而S-TR引物扩增后无条带出现时，该样品可确定为敏感菌株。尤其是前期的分离培养、收集菌丝再提取基因组DNA，费时至少需要1～2周时间(李红霞，周明国，陆悦健.应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性，菌物系统，2002，21(3)370-374)。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供核盘菌抗多菌灵的检测基因及一种快速检测方法。针对现有技术中ASO-PCR检测核盘菌技术中提取基因组DNA的过程复杂、花费时间长，不适宜进行大量检测，检测准确率不太高的缺陷，通过改进方法能在油菜发病期及时检测抗药性，在短时间内进行大量、简便的检测，检测准确率达到95％以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。技术方案核盘菌抗多菌灵的检测基因，其β-微管蛋白基因，长度为1685 bp，相应的编码β-微管蛋白的477个氨基酸，包含第198位氨基酸的抗药性突变位点Glu(GAG)→Ala(GCG)，序列见SEQ ID NO.1。一种核盘菌抗多菌灵的检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR扩增程序，其特征在于在基因组DNA的提取过程中，配制提取缓冲液100mM LiCl；10mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0；10g/L SDS，蒸馏水补足到所需体积配制抽提液苯酚∶氯仿∶异戊醇体积为25∶24∶1；TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20 mg/L RNAase；蒸馏水补足到所需体积采集菌核将采集核盘菌菌核分别切下一小块30～50mg，3.5％(mg/L)NaClO3消毒后5min；基因组DNA的提取在消毒后的油菜菌核病菌核块中加入1.5mL提取缓冲液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃温浴10min，10000rpm离心4min后，上清液用等体积上述抽提液抽提1～2次，上清液加等体积异丙醇沉淀干燥后溶于200μL TE，37℃水浴10min，取2μL用0.7％(g/L)琼脂糖电泳检测全部有亮带，说明已提取出该菌核的基因组DNA；紫外分光光度计检测其基因组DNA的含量。提取的基因组DNA直接用于ASO-PCR检测。引物及反应条件参考(李红霞，周明国，陆悦健。应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性，菌物系统，2002，21(3)370-374)。即用上游引物S-TR(5’TCGAGAACTCTGACGC 3’)和S-TS(5’TCGAGAACTCTGACGA 3’)及下游引物SS-1(5’AAGATAGCAGAGCAGGT 3’)直接以核盘菌基因组DNA为模板扩增β-微管蛋白基因部分片段。50μL反应体系中含100ng模板DNA，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U(上海Promaga公司)。反应在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上进行，反应条件94℃ 5min；60℃ 40s，72℃ 50s，94℃ 30s 30个循环；72℃ 5min；4℃保存。取10μL PCR产物于1.5％(g/L)琼脂糖TBE胶上电泳，紫外观察照相。供试菌核100个，其中48个菌核用引物对S-TR/SS-1能扩增出373bp的条带，为抗药性菌株；另外52个菌核用引物对S-TS/SS-1能扩增出373bp的产物，为敏感菌株。有益效果本专利技术核盘菌抗多菌灵的检测方法，与现有技术相比，具有如下优点和积极效果1、本专利技术是国际上首次报道的核盘菌抗多菌灵的检测基因，其中包括β-微管蛋白第198位氨基酸的突变位点(Glu→Ala)，为今后核盘菌抗多菌灵的检测提供理论依据。2、核盘菌基因组DNA现有技术的提取方法是要经过田间采集菌核、室内分离培养3天、PD液体培养基(马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL)培养至少6天获得菌丝、无菌蒸馏水冲洗、冷冻干燥菌丝1天、液氮研磨等步骤才可用于提取基因组DNA。用Moller的方法在提取过程中多糖较多，且多次抽提也难以去除干净(李红霞，周明国，陆悦健。应用PCR方法检测油菜菌核病菌即核盘菌对多菌灵的抗药性，菌物系统，2002，21(3)370-374)。本专利技术从采集回来的菌核中直接提取基因组DNA时，省去了现有技术中的分离培养、提取前用PD液体培养基静止培养，待菌丝布满液面后收集，冷冻干燥等多项步骤，操作简便，只需要3h即可提取出基因组DNA，节省了10d的时间，大大加快了检测速度。本专利技术采用这种提取缓冲液效果最好，多糖少，DNA含量高，紫外分光光度计检测DNA含量为1mg/L，与从分离培养获得的菌丝中提取量一样很高。3、目前国内其他研究单位均采用菌丝生长法检测油菜菌核病菌抗药性，但该方法涉及采样、分离培养需要3d和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长。随着杀菌剂抗药性分子机制研究的深入，利本文档来自技高网...

【技术保护点】
核盘菌抗多菌灵检测基因，其β－微管蛋白基因，长度为１６８５ｂｐ，相应的编码β－微管蛋白的４７７个氨基酸，包含第１９８位氨基酸的抗药性突变位点Ｇｌｕ（ＧＡＧ）→Ａｌａ（ＧＣＧ），全序列见ＳＥＱＩＤＮＯ．１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周明国，李红霞，陆悦健，王建新，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]