人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）通用探针及引物ＰＣＲ检测技术是体外生物诊断的一部分。该技术选用了针对ＨＩＶ－１及ＨＩＶ－２各亚型的通用正义引物、通用反义引物及通用分子信标探针，并用荧光分子信标探针ＰＣＲ检测技术。该探针５’标记ＦＡＭ，３’标记ＤＡＢＣＹＬ。由该方法组成的检测试剂盒对各种ＨＩＶ亚型标准血清及临床血清，获得该试剂盒用于ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２检测的各种参数为：特异性１００％、敏感性９５％、重复性ＣＶ值＜１０％、ＨＩＶ检测的最低含量为５０拷贝／ｍｌ。本发明专利技术还详述了荧光分子信标的基本原则及ＨＩＶ荧光分子信标ＰＣＲ检测技术的具体方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
体外生物医学诊断技术(荧光分子信标PCR检测技术)二、
技术介绍
分子信标是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(FRET)现象设计的。当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象即是荧光FRET。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈106比例显著减弱。HIV分子信标PCR荧光定量技术正是基于这样的原理设计的，该技术为HIV感染的早期诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。该技术通过筛选数千条HIV-1及HIV-2基因序列，获得针对HIV-1及HIV-2各亚型、各分离株检测的特异、通用引物及分子信标探针，通过检测各种HIV标准血清及临床血清，确定该试剂盒的各种检测指标，并以国际上公认的HIV bDNA检测试剂盒作为对照，确定该试剂盒检测的特异性、敏感性及检测的最低拷贝数，为HIV的确诊、大规模筛选、病情程度判断、疗效评价、新药开发等提供一个简便、价廉的检测手段，并最终将取代极为昂贵的进口bDNA定量检测试剂盒。其关键技术为获得针对各种HIV亚型及分离株的特异、敏感的通用引物及通用分子信标探针，制备高特异性、高敏感性、重复性好的HIV-1/HIV-2 PCR检测试剂盒。
技术实现思路
该技术选用了针对HIV-1及HIV-2各亚型特异、通用的引物及分子信标探针，通过检测各种HIV标准血清及临床血清，确定其检测HIV的各种检测指标特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％、HIV检测的最低含量为50拷贝/ml，证实所采用的通用引物及通用荧光探针具有很好的敏感性、特异性及重复性。具体实施例方式1、样本处理及反转录cDNA链合成300μl血清+120μl RNA裂解液，振荡10S；混匀冰浴5min；420μl酚抽提一次，振荡20S，12000r/min离心1min；上清加350μl异丙醇，室温5min；500μl 75％乙醇洗涤沉淀，吸水纸洗干，37℃晾干10min，备用(如需保存RNA，则加入DEPC处理水，-20℃保存)。加入9μl逆转录反应液及1μl AMV酶，12000r/min离心10S，42℃水浴45min。2、探针标记荧光分子信标探针序列的5’端及3’端分别用FAM及DABCYL标记。3、PCR扩增取Taq酶1U加入反应液管内(反应液1.0μM正义引物，1.0μM反义引物，1.0μM荧光分子信标探针，1.5mM Mg2+，50mM Tris，50mM KCl)，然后将样本、阴性对照或阳性对照的反转录液各5μl分别加入反应液管内，混匀后10000r/min离心10s上机扩增(同时设空白对照一管空白对照只需在反应液管内加Taq酶1U、去离子水5μl混匀后10000r/min离心10s上机扩增)。扩增程序94℃预变性5min，循环条件94℃ 30S，60℃ 65S，共40个循环；60℃延伸7min，最后28℃保温3min。4、荧光检测待各PCR反应液管降至28℃后迅速放入荧光检测仪，读取并记录荧光值，荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。5、结果分析①荧光值确定Ax＝样本或各对照管荧光值-空白对照管荧光值 ②实验有效性判别阴性对照值Ax值(An)小于10时按10计算；阴性对照值大于20则本次实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。③结果判定在实验有效的情况下样本Ax≥An×2.5判为阳性；Ax≤An×2.1判为阴性；An×2.1＜Ax＜An×2.5为实验灰区，需重复实验一次，若重复实验结果样本Ax≥An×2.1判为阳性，否则判为阴性。权利要求1.本试剂盒所使用的探针序列(GTAAAAAATTGGATGACAGAAACC)要求保护，其它类似GTAAAAAATTGGATGACAGAAACC序列制备的HIV探针或引物的方法也要求保护；2.本试剂盒所使用的PCR正链引物序列(TATGTAGATCGGTTCT)要求保护，其它类似TATGTAGATCGGTTCT序列制备的HIV PCR引物及探针的方法也要求保护；3.本试剂盒所使用的PCR反义引物序列(CAATCTGGGTTCGCATT，其正义链为AATGCGAACCCAGATTG)要求保护，其它类似CAATCTGGGTTCGCATT序列制备的HIV PCR引物及探针的方法也要求保护。全文摘要人类免疫缺陷病毒(HIV)通用探针及引物PCR检测技术是体外生物诊断的一部分。该技术选用了针对HIV－1及HIV－2各亚型的通用正义引物、通用反义引物及通用分子信标探针，并用荧光分子信标探针PCR检测技术。该探针5’标记FAM，3’标记DABCYL。由该方法组成的检测试剂盒对各种HIV亚型标准血清及临床血清，获得该试剂盒用于HIV－1/HIV－2检测的各种参数为特异性100％、敏感性95％、重复性CV值＜10％、HIV检测的最低含量为50拷贝/ml。本专利技术还详述了荧光分子信标的基本原则及HIV荧光分子信标PCR检测技术的具体方法。文档编号C12Q1/68GK1515687SQ0310121公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月12日 优先权日2003年1月12日专利技术者王虹, 王 虹 申请人:王虹, 王 虹本文档来自技高网...
【技术保护点】
本试剂盒所使用的探针序列（ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣ）要求保护，其它类似ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣ序列制备的ＨＩＶ探针或引物的方法也要求保护。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王虹，
申请(专利权)人：王虹，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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